甘蔗S_腺苷甲硫氨酸合成酶基因_ScSAM_的克隆及表达.pdf
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1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(6): 10021010 http:/zwxb.chinacrops.org/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: 本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102604), 国家国际合作项目(2013DFA31600), 广西科学研究与技术开发计 划项目(桂科产1123008-1、桂科攻1222009-1B、桂科合1347004-2), 广西八桂学者、特聘专家专项基金, 广西自然科学基金项目 (2011GXNSFF018002、2013NXNSFAA01907
2、3)和广西农业科学院团队项目(桂农科2011YT01)资助。 * 通讯作者(Corresponding authors): 杨丽涛, E-mail: , Tel: 0771-3236407; 李杨瑞, E-mail: , Tel: 0771-3247689 第一作者联系方式: E-mail: Received(收稿日期): 2013-11-17; Accepted(接受日期): 2014-03-04; Published online(网络出版日期): 2014-04-09. URL: http:/ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01002 甘蔗 S-腺苷甲硫氨酸合
3、成酶基因(ScSAM)的克隆及表达 宋修鹏 1 张保青2 黄 杏2 杨丽涛1,2,* 李杨瑞1,2,* 1 广西大学农学院 / 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西南宁 530004; 2 广西农业科学院 / 中国农业科学院甘蔗 研究中心 / 农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室 / 广西甘蔗遗传改良重点实验室, 广西南宁 530007 摘 要: 利用 RT-PCR 和 RACE 技术从甘蔗品种新台糖 22 (ROC 22)中克隆获得 SAM 基因的 cDNA 序列, 命名为 ScSAM, GenBank 登录号为 KC172558。 用生物信息学方法预测分析其序列, cD
4、NA 全长 1466 bp, 含有 1 个 1191 bp 的 完整开放阅读框(ORF), 编码 396 个氨基酸, 与高粱和玉米等植物的 SAM 蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显 示, 甘蔗 ScSAM 与高粱的 SAM 蛋白亲缘关系较近。 Real-time PCR 分析表明 ScSAM 为组成型表达, 在根中的表达量 最高, 是叶中表达量的 3.6 倍。 其在黑穗病菌胁迫和低温(4)、 聚乙二醇(PEG)、 NaCl 非生物胁迫下均被诱导表达, 但 表达模式不同; 在 H2O2胁迫下其表达被抑制。推测其可能参与甘蔗抗黑穗病过程, 且在甘蔗抗寒、抗旱、抗盐和抗 氧化等胁迫过程中也起某种
5、作用。 关键词: 甘蔗; S-腺苷甲硫氨酸合成酶; 克隆; 表达分析 Cloning and Expression of Sugarcane S-adenosylmethionine Synthetase Gene ScSAM SONG Xiu-Peng1, ZHANG Bao-Qing2, HUANG Xing2, YANG Li-Tao1,2,*, and LI Yang-Rui1,2,* 1 Agricultural College / State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bio
6、resources, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2 Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Sugarcane Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement (Guangxi), Ministry of Agriculture / Guangxi Key Laboratory of Su
7、garcane Genetic Improve- ment, Nanning 530007, China Abstract: The full-length sequence cDNA of ScSAM (GenBank accession number: KC172558) was cloned from sugarcane vari- ety ROC 22 using RT-PCR combined with RACE techniques. This sequence consists of 1466 bp with an intact open reading frame of 119
8、1 bp, encoding a polypeptide of 396 amino acids. Homology analysis showed that the deduced ScSAM protein was highly homologous to SAM proteins from different species. Phylogenetic analysis indicated that ScSAM was closely related to the SAM of sorghum. Real-time PCR results showed that the ScSAM gen
9、e constitutively expressed in plant, with different expression levels in root, stalk and leaf. The transcript of ScSAM in root was the highest among the three organs, which was 3.6 times higher than that in leaf. Furthermore, ScSAM transcription was induced by biotic (smut infection) and abiotic (lo
10、w temperature, PEG and NaCl) stresses, but the expression patterns were different. Under oxidative stress (H2O2), the expression of ScSAM was inhibited. We suggested that ScSAM might participate in smut-resistant activities in sugarcane, and also play a role in sugarcane resistances to chill, drough
11、t, salt and oxidation stresses. Keywords: Sugarcane; S-adenosylmethionine synthetase (SAM); Clone; Expression analysis 甘蔗(Saccharum officenarum L.)是我国最主要 的糖料和能源作物1。甘蔗安全生产受到干旱、盐 渍、极端温度和病虫害的威胁, 利用基因工程的方 法可以有效提高甘蔗的抗逆性2, 而挖掘抗逆基因 第6期 宋修鹏等: 甘蔗 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM)的克隆及表达 1003 是首要基础。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosyl-
12、methionine synthetase, SAM)是植物代谢过程中的一 个关键酶, 它是生物合成多胺和乙烯等的前体, 参 与了植物的转氨丙基、转甲基和转硫等多种重要的 生化反应过程, 还能催化 ATP 与甲硫氨酸反应生成 S-腺苷甲硫氨酸3-5。 此外, SAM 还可与 RNA 结合参 与体内基因表达的调控6-7。因此, 对 S-腺苷甲硫氨 酸合成酶基因的研究在植物逆境生理、衰老生理、 植物生物代谢及其调控研究上均具有重要的意义。 现已证实多胺和乙烯均积极地参与了植物的抗逆反 应, 因而推测 SAM在植物抵御逆境的过程中也发挥 重要的作用8-9。目前已从番茄10、盐地碱蓬11、玉 米12、
13、石蒜13和大豆14等植物中克隆获得 S-腺苷甲 硫氨酸合成酶基因的 cDNA 序列, 但迄今尚未见有 甘蔗SAM基因克隆及其在不同组织和不同胁迫条件 下表达特性研究的报道。 本研究在前期甘蔗幼苗响应黑穗病菌侵染的蛋 白质组学研究的基础上(尚未发表), 通过 RT-PCR 和 RACE 技术克隆了甘蔗 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 的全长, 用生物信息学分析该基因的序列特征, 最 后利用 Real-time PCR 技术研究其在不同组织和不 同胁迫下的表达特性, 以期为该基因在甘蔗抗逆特 别是抗病育种中的应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 以甘蔗品种 ROC 22 为材料, 经过
14、炼苗, 选取生 长健壮一致的组培苗种植在沙土比例为 11 的黑 色塑料桶(上径 40 cm, 下径 30 cm, 高 40 cm)中, 置 广西大学甘蔗智能温室大棚, 水分含量控制在田间 持水量的 70%左右, 待其长到 67 片真叶时分组处 理。一组针刺接种黑穗病菌15, 将采集的萌发率在 95%以上的黑穗病病原菌孢子用灭菌的 ddH2O 稀释 成 5106个 mL1的悬浮液, 用灭菌的一次性注射器 在甘蔗的生长点针刺 4 次, 然后沿着叶鞘滴 4 滴孢 子悬浮液, 对照组以 ddH2O 代替孢子悬浮液, 0、 1、 2、 3和4 d后从针刺位点下2 cm取样; 二组在4处理室 (白昼 16
15、 h/8 h, 湿度 65%)低温处理; 三组用 10 mmol L1 H2O2喷洒叶面; 另两组分别用 100 mmol L1 NaCl 和 15% PEG 浇灌; 上述处理均于 0、6、12、 24、 48 和 72 h 后取样。 另取不处理的健康甘蔗 ROC 22 根、茎、叶样品作对照。各样品经液氮速冻, 于 80保存备用。 1.2 试验所用试剂 胶回收试剂盒购自 Bioflux 公司, Dream Taq 酶 购自 Fermentas 公司, pMD18-T 载体、Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒、 Primescript RT Reagent Kit 和
16、SYBR Premix Ex Taq 均购自 TaKaRa 公司, TRIzol 试剂购自北京康为试剂公司, 其他试剂均为 国产分析纯。 1.3 蛋白质点的质谱鉴定 差异蛋白质点经胰蛋白酶酶解后, 取 0.5 L 点 入串联飞行时间质谱仪(4700 Proteomics Analyzer) 的MALDI-TOF靶中, 在校准点内加入外标(已知质 量数的肽混合物)。利用反射模式采集蛋白质的一 级质谱信息(MS), 质量范围在 8004000 Da, 激光 强度为 4000。一级质谱扫描完成后, 取信号强度最 高的母离子进行二级质谱分析(MS/MS), 用2 kV的 高电压加速, 用 CID碰撞裂
17、解母离子后获取每个母 离子的离子碎片指纹谱。随后将一级和二级质谱数 据导入 GPS 软件, 利用 MASCOT 搜索算法对质谱 数据综合分析, 搜索 Uniprot 蛋白质数据库(全部生 物种类)和 NCBI (植物)中与试验材料相匹配的相关 蛋白质。 1.4 总 RNA 的提取及 cDNA 的合成 选用 TRIzol 试剂提取甘蔗幼苗总 RNA, 利用琼 脂糖凝胶电泳和 Thermo Scientific NanoDrop 2000/ 2000C 检测 RNA 的完整性和浓度。参照 Reverse Transcriptase M-MLV 试剂盒的说明书稍作修改合成 基因克隆所用 cDNA 模
18、板, 逆转录引物为 RT-P: 5-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTT TTTTTT-3。按照 Primescript RT Reagent Kit 说明书 合成荧光定量 PCR 所用 cDNA 模板, 将样品稀释至 50 ng L1保存于20备用。 1.5 ScSAM 的克隆及生物信息学分析 以质谱鉴定的 SAM蛋白氨基酸序列为参照, 通 过 Blast 分析, 选取同源性较高的核酸序列, 利用 Vector NTI 11.0设计兼并引物SAM-F: 5-ATGGC(A,C) G(G,C)(G,A,T)(G,C)T(C,T)GA(C,T)ACCTTCCTCTT-
19、 3, 下游用逆转录加尾引物 3端: 5-GGCCACGCG TCGACTAGTAC-3。反应体系为 cDNA 1.0 L、2.5 mmol L1 dNTPs 2.0 L、10 mol L1上下游引物各 1.0 L、10buffer 2.5 L、Dream Taq 酶 0.15 L 和 ddH2O 17.35 L。 反应程序为 95 5 min; 94 35 s, 58 35 s, 72 1.5 min, 35 个循环; 72 10 min。 RT-PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳, 切胶回收 1004 作 物 学 报 第 40 卷 目标条带, 与 pMD18-T 载体连接后转化大肠杆菌
20、感 受态细胞 DH5, 37过夜培养, 挑取阳性克隆, 经 菌体 PCR 验证后送深圳华大基因科技服务有限公司 测序。结果经 Blast 确认为 SAM 基因, 设计引物 SAM-ORF-F: 5-ATGGCCGGTCTCGACACCTTCCT CTT-3和 SAM-ORF-R: 5-TTAGGCAGAAGGTTTC TCCCACTTGAG-3扩增基因的完整 开放阅读框 (open reading frame, ORF)。反应体系及反应程序同 3RACE。 用 BioXM 2.6 软件预测 ScSAM 编码的氨基酸序 列; 用 NCBI-Protein Blast (http:/blast.n
21、cbi.nlm.nih. gov/)在线分析 ScSAM 与其他物种的同源性; 用 ExPASy Proteomics Server的ProtScale程序预测分析 ScSAM 的亲水性和跨膜结构; 在线 http:/isoelectric. ovh.org/预测 ScSAM 编码氨基酸的等电点和蛋白质 分子量; 用 SOSUIsignal 软件预测 ScSAM 的信号肽; 用 SOPMA 软件预测其二级结构; 用 SMART 和 Motif Scan 软件分析其蛋白质功能结构域; 用 Mega 5.0 软件构建 SAM 氨基酸序列进化树。 1.6 ScSAM 的实时荧光定量 PCR 分析 根
22、据获得的 ScSAM 序列设计荧光定量 PCR 引 物 Y-SAM-F: 5-GAGACAGTCACCAATGATGA-3, Y-SAM-R: 5-ATGGGTTAAGGTGGAAGATG-3; 以 甘蔗 GAPDH (NCBI 登录号为 EF189713)为内参基 因, 内参引物为 Y-GAPDH-F: 5-AAGGGTGGTGCC AAGAAGG-3和 Y-GAPDH-R: 5-CAAGGGGAGCA AGGCAGTT-3 16。利用 LightCycle480 荧光定量 PCR 仪分析, 反应体系 20 L, 含 2.0 L 的 50 ng L1 cDNA 模板、10 mol L1各 0
23、.8 L 上下游引物、 10.0 L SYBR Premix Ex Taq II、 6.4 L ddH2O, 每个 样品 3 个重复。反应程序为 95 30 s; 95 5 s, 60 20 s, 共 45 个循环; 95 1 s, 65 15 s, 95延续, 溶解曲线测定; 40 30 s。 利用 2CT法计算基因的 相对表达量。 2 结果与分析 2.1 质谱鉴定 本课题组前期利用蛋白质双向电泳技术研究甘 蔗幼苗响应黑穗病菌侵染时发现蛋白点 8 在接菌处 理和对照样品中其相对表达量分别为 10.34 和 5.10 (图 1)。 质谱鉴定分析(表 1)发现, 其与牛奶子和野生 图 1 差异蛋
24、白质点 8 相对表达量变化 Fig. 1 Relative expressions of the differentially expressed protein spot 8 表 1 质谱分析结果 Table 1 Mass spectrometry results 蛋白名称 Protein name 登录号 Accession No. 蛋白分子量 Protein MW (kD) 匹配肽段序列 Matched peptide sequence 匹配肽段数 Matched peptide 蛋白得分 Protein score 蛋白得分的 统计学可靠程度 Protein score C.I. (%
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