甜瓜属线粒体基因组的父系遗传特性.pdf
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1、园艺学报,() : 2014411122502258 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: 收稿日期:收稿日期:20140714;修回日期:修回日期:20141103 基金项目:基金项目:国家自然科学基金重点项目(31430075) ;国家自然科学基金面上项目(31071801) ;国家重点基础研究发展计划项目 (2012CB113900) ;863 计划专项 (2012AA100202) ; 公益性行业 (农业) 科研专项 (201403032) ; 国家科技支撑计划项目 (2013BAD01B04-10) 甜
2、瓜属线粒体基因组的父系遗传特性 赵 娟,沈 佳,李海梅,娄群峰,李 季,陈劲枫* (南京农业大学园艺学院,作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京 210095) 摘 要:摘 要:为分析甜瓜属线粒体基因组的遗传特性,选取甜瓜属 11 个不同种植物为试验材料,采用成 熟花粉 DAPI 压片染色方法结合树脂半薄切片 MTG-DAPI 双染色技术,观察花粉贴壁期和成熟期细胞中 的线粒体分布。结果显示,所涉及的 11 种甜瓜属植物均同黄瓜一样,成熟花粉细胞生殖核周围或精细胞 中存在线粒体 DNA;而作为对照的南瓜和西葫芦的花粉细胞发育到成熟期时生殖核周围没有任何细胞器 DNA。上述结果表明,甜瓜属植物线
3、粒体 DNA 有可能通过花粉进行遗传和散布。这个结果将线粒体基因 组父系遗传潜力特性扩展到甜瓜属,为进一步探究植物线粒体基因组的父系遗传机制奠定基础。 关键词:关键词:甜瓜属;父系遗传;线粒体;MTG-DAPI 双染色 中图分类号:中图分类号:S 642.2 文献标志码: 文献标志码:A 文章编号: 文章编号:0513-353X(2014)11-2250-09 Detection of the Paternal Mitochondrial Inheritance in Cucumis ZHAO Juan,SHEN Jia,LI Hai-mei,LOU Qun-feng,LI Ji,and CH
4、EN Jin-feng* (College of Horticulture,the State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China) Abstract:Molecular analyses of cytoplasmic DNA are useful tools for evaluating the systematic position of one genus. The determination of ch
5、loroplast and mitochondria inheritance is a pre-requisite for the use of organelle DNA. For the vast majority of angiosperm,mitochondria are maternally transmitted. However study showed that mitochondria of cucumber(Cucumis sativus L.)and melon(C. melo L.)are paternally transmitted. In order to stud
6、y the unique model for organellar genetics, we detected the modes of mitochondrial inheritance of eleven different species in Cucumis by cytological observation here. Organellar DNA in mature pollen grains was observed by 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) fuorescence microscopy combined with the co
7、nventional“squash method”. And then mitochondrial DNA in premature and mature pollen grains was observed by 7 100 resin sections double-stained with DAPI and Mito traker green (MTG) fuorescence microscopy. All thirteen species were classified into two types based on the presence or absence of mitoch
8、ondrial DNA in mature generative cells or sperm cells. Eleven species in Cucumis could be grouped together with cucumber, which only had mitochondrial DNA, while pumpkin and squash had neither mitochondrial nor plastid DNA. The presence or absence of mitochondrial DNA corresponded to paternal/bipare
9、ntal inheritance or maternal inheritance of mitochondrial. So the result * 通信作者 Author for correspondence(E-mail:) 11 期 赵 娟等:甜瓜属线粒体基因组的父系遗传特性 2251 revealed that all the species in Cucumis used here had the potential for paternal mitochondrial inheritance, while the control materials displayed matern
10、al cytoplasmic inheritance. These data provide a foundation for further studies on the molecular mechanisms of mitochondrial paternal inheritance in angiosperms. Key words:Cucumis;paternal inheritance;mitochondrial;MTG-DAPI double-stain 线粒体和叶绿体是植物细胞中含有遗传物质的细胞器,它们分散存在于细胞质之中,世代遗传 不遵循孟德尔遗传规律,并且根据后代细胞器基
11、因组来自于母本、父本和双亲,分为单亲母系、单 亲父系以及双亲遗传。Correns(1909)在天竺葵(Pelargonium zonale)中发现了非孟德尔遗传现象, 后来又有研究指出植物花粉粒中缺少可遗传的质体,引起了研究者的注意(Heifetz,2000) 。经长期 探索至今已经有 600 多个种(属)的被子植物的细胞质遗传方式得到确定,并发现在所有的被子植 物中质体大多数(81%)都是单亲母系遗传(Mogensen,1996;Birky,2008) 。 而关于线粒体遗传方式的探索则是在发现线粒体有 DNA 之后(Nass & Nass,1963) ,并且首先 开始于动物线粒体遗传研究(D
12、awid & Blackler,1972) ,动物中线粒体呈现出严格的母系遗传。之 后大量研究显示了植物线粒体比质体更严格的母系遗传方式,至今所研究的被子植物中,已报道的 只有衣藻属(Nakamuru,2010) 、甜瓜(Havey et al.,1998) 、黄瓜(Calderon et al.,2012)和吊兰 (Zhang,2003)等极少数植物存在父系遗传或双亲遗传现象。 线粒体父系遗传的植物中细胞质基因的传播和核质基因互作呈现出特殊性,可以为细胞器基因 组间信息交流研究提供重要信息(Hu et al.,2008) 。黄瓜和甜瓜的线粒体遗传方式为罕见的父系遗 传,子代线粒体基因均来自父
13、本,重组率相对核基因组要低,而叶绿体 DNA 则为单亲母系遗传, 它反映由种子带来的基因流的大小(Ennos,1994;Shaw,2002) 。因此研究甜瓜属内其他材料的线 粒体遗传方式,查找发生父系遗传方式转变的分歧点,对于在细胞及分子水平上深入研究细胞器的 遗传机理具有很大的必要性。 细胞器基因信息是鉴定植物界属种关系的重要依据,而确定细胞器基因组的遗传方式是进行相 关分析的基础。 本研究中对甜瓜属 11 种材料的成熟花粉进行了 DAPI 压片, 染色观察其细胞器 DNA 信息的存在情况,以确定是否存在细胞器父系遗传的可能,进而运用 MTG-DAPI 双染色体系,同时 选择贴壁期和成熟期两
14、个时期的花粉进行观察,用以进一步区分 DAPI 压片染色中生殖核周围存在 基因组的细胞器是线粒体还是叶绿体,从而确定甜瓜属线粒体基因组的父系遗传特性,为进一步探 索线粒体父系遗传植物中线粒体持续存在甚至发生增长的生理机制及在线粒体母系遗传植物中验证 线粒体如何消失的假说提供线索。 1 材料与方法 1.1 材料 选择葫芦科甜瓜属中甜瓜(Cucumis. melo) 、越瓜Cucumis melo L. var. conomon(Thunb.) Makino、 黄瓜变种 (C. sativus var. xishuangbannesis、 C. sativus var. hardwickii) 、
15、 酸黄瓜 (C. hystrix) 、 甜瓜属内黄瓜的野生近缘种(C. dipsaceus、C. anguria、C. myriocarpus、C. africanus、C. metuliferus 和 C. sagittatus)共 11 个种的材料进行 DAPI 染色和半薄切片双染色,同时选择葫芦科的西葫芦 (Cucurbita pepo L.)和南瓜(Cucurbita moschata D.)作为对照(表 1) 。 所有的材料均于 2013 年 3 月上旬播种在含有基质的营养钵中,经 40 d 苗期生长后定植在南京 农业大学江浦园艺试验田的塑料大棚中栽培并取雄花花蕾。 2252 园 艺
16、 学 报 41 卷 表表 1 MTG-DAPI 双染色试验材料双染色试验材料 Table 1 Materials for MTG-DAPI double staining 编号 Code 名称 Name A 酸黄瓜 Cucumis hystrix Chakrav. B 哈氏黄瓜 Cucumis sativus L. var. hardwickii(Royle)Gabaev C 西双版纳黄瓜 Cucumis sativus L. var. xishuangbannesis Qi et Yuan D 甜瓜 Cucumis melo L. subsp melo E 越瓜 Cucumis melo L
17、. var conomon(Thunb.)Makino F 黄瓜野生近缘种 Cucumis dipsaceus Ehrenb. ex Spach G 黄瓜野生近缘种 Cucumis sagittatus Peyr. H 黄瓜野生近缘种 Cucumis myriocarpus Naudin I 黄瓜野生近缘种 Cucumis africanus L. f. J 黄瓜野生近缘种 Cucumis anguria L. K 非洲角 Cucumis metuliferus E. Mey. ex Naudin M 南瓜 Cucurbita moschata Duchesne ex Poir. N 西葫芦
18、Cucurbita pepo L. 1.2 方法 1.2.1 DAPI 压片染色 DAPI(4,6二脒基2苯基)可以对 DNA 进行染色,使用 DAPI 染色对成熟花粉细胞进行 观察,若能在细胞质中观察到生殖核周围的细胞器 DNA,则表示此处存在线粒体或者叶绿体。操作 步骤参照 Zhang 等(2003)的方法:采集所有材料的成熟新鲜雄花花朵放于铺有湿润吸水纸的培养 皿中,取干净载玻片,滴加戊二醛固定液和 DAPI 染色液各 10 L,取一个花药放置在混合液中,用 镊子挤压出花粉,盖上盖玻片,铺上滤纸,用拇指用力向一个方向挤压(不可多次挤压) ,黑暗条件 下静置 2 min,待 DAPI 与
19、DNA 充分结合后,置于荧光显微镜下,选择紫外激发光进行观察。 1.2.2 MTG-DAPI 双染色 由于 DAPI 压片染色的结果不能区分具体是线粒体还是叶绿体,所以运用 Technovit 7100 树脂 半薄切片 MTG-DAPI 双染色技术,通过对 DNA 及线粒体膜进行特异染色来区分花粉生殖细胞核周 围的细胞器基因来源。 运用醋酸洋红染色确定花粉的发育时期,选择贴壁期和成熟期的花粉进行 Technovit 7100 树脂 半薄切片制样(Sodmergen et al.,2002) 。切片完成后依据植物花粉壁对荧光染色剂的吸附情况以确 定是否需要用 TBO(甲苯胺蓝)染料进行预处理。具
20、体操作步骤为将脱树脂处理过的切片转移到 5 g L-1TBO(甲苯胺蓝粉末溶于 70%乙醇)染色液中染色 40 min。本研究中不需要用 TBO 进行处 理的材料有 C. melo L. subsp melo、 C. melo L. subsp conomon、 C. sagittatus、 C. africanus 和 C. anguria, 其他材料的花粉需要用 TBO 进行预染色处理。 MTG(Mito traker green)是线粒体膜特异染料,可以对线粒体结构进行确认。预染色结束后 进行 MTG 染色。贴壁期花粉细胞的染色条件为:在 20 nmol L-1的 MTG 工作液(MTG
21、 储液为 1 mmol L-1的 Mito Tracker Green FM的 DMSO(二甲基亚砜)溶液,无水乙醇稀释 MTG 储液 50 000 倍即为 MTG 工作液) 中静置 30 min。 成熟期花粉细胞的染色条件为 2 10-5 nmol L-1的 MTG 工作液染色 10 min。MTG 染色结束后将切片置于摇床上,在 50%乙醇中清洗 3 min,再在蒸馏水中 清洗 3 min, 最后用滤纸吸除多余的水分。 在切片上滴加浓度为 0.1 g mL DAPI 溶液染色 6 min (黑 暗下) 。 DAPI 溶液的配置: 将 DAPI 粉末溶于 Tan buffer (含 20 m
22、ol L-1 Tris HCl, 0.5 mmol L-1 EDTA, 1.2 mol L-1亚精胺和 7 mol L-1 巯基乙醇)中配制成浓度为 100 mg mL-1的储存液,使用时用 11 期 赵 娟等:甜瓜属线粒体基因组的父系遗传特性 2253 Tan buffer 将储液稀释至 0.1 g mL-1。 DAPI 染色完成后的切片用吸水纸吸取染液, 即可置于荧光显 微镜下观察,先在蓝光下观察 MTG 染色结果,再在紫外光下观察 DAPI 染色图像并拍照。 1.2.3 图片采集 DAPI 染色后的激发光为蓝色,MTG 激发后产生绿色荧光。为了便于对标记位点进行识别,图 像采集采用黑白模
23、式,所以图像中显示黑色的区域即为被染料着色的区域。 2 结果与分析 2.1 DAPI压片染色结果 细胞质中线粒体和叶绿体均含有 DNA 结 构,而且 DNA 与其结合的蛋白结构形成紧密 的拟核区域, 当这个区域DNA与DAPI结合时, 经过紫外光激发,可观察到这些细胞器 DNA 呈现的是实心点状颗粒。 本试验结果显示, 花粉经压片后发生破裂, 压片适当时会只有一个伤口,细胞质都从这个 破裂的细胞壁位置溢出,内部包含有细胞质中 的绝大部分物质,如生殖核、营养核和各种细 胞器(图 1) 。 图图 1 甜瓜属成熟花粉细胞的甜瓜属成熟花粉细胞的 DAPI 染色结果染色结果 箭头所示为细胞质 DNA。P
24、W:花粉壁;RN:生殖细胞核; VN:营养细胞核。 Fig. 1 DAPI-stained epifluorescence microphotograph of mature pollen grain in Cucumis Arrows indicate the fluorescent spots of cytoplasmic DNA. PW:Pollen wall;RN:Reproductive nucleus;VN:Vegetative nucleus. 观察发现,细胞质着色区域中可明显区分 出 1 个或 2 个染色较深的生殖细胞核和 1 个染 色浅且相比生殖核分散的营养细胞核。本研究 中
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- 甜瓜 线粒体 基因组 父系 遗传 特性
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