毛细管电泳原理及分析策略CE.ppt
《毛细管电泳原理及分析策略CE.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《毛细管电泳原理及分析策略CE.ppt(61页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、毛细管电泳分离原理及分析策略,CE分离原理-与模式有关,毛细管区带电泳(CZE) 毛细管胶束电动色谱(MECC/MCKC) 毛细管凝胶电泳(CGE) 毛细管等电聚焦(cIEF) 亲和毛细管电泳(ACE) 毛细管电色谱(CEC),第一章 毛细管区带电泳,样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离,比值愈大,跑得愈快,进样方式,压力进样 电动进样 浓缩进样,毛细管种类,非涂层毛细管(裸管) 内壁涂层毛细管(涂层管),非涂层毛细管-电渗流的概念,电渗流的特点,纯电泳状态,电泳+电渗流,电渗流的作用,电渗流的活塞流特点,Hydrodynamic flow Parabolic Resistan
2、ce to flow at surface More diffusion/broader detection zone,EOF gives plug flow Minimizes band broadening Narrows detection zone,Hydrodynamic flow Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader detection zone,EOF gives plug flow Minimizes band broadening Narrows detection zone,电渗流的活塞
3、流特点,电渗流是CE中最大的驱动力来源之一,电渗流的正面及负面作用,正面作用 增加分离速度 使得正、负电荷物质同时分离,负面作用 减少分离时间和分离有效距离 电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性,影响电渗流的因素,pH值 pH越高,电渗流越大 离子强度 离子强度越高,电渗流越小 缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精,电渗流随pH的变化情况,控制电渗流的三个重要手段,采用涂层毛细管,消除电渗流的影响 改变pH,从而调整电渗流的大小。pH10以后,电渗流基本不增加 添加剂:有机溶剂可以降低电渗流的大小,从而增加分离的有效距离;表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小,主要是在阴离
4、子分析时使用,缓冲溶液的影响和选择,在CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液: 在所选的pH范围内有较强缓冲能力; 在检测波长处有低的紫外吸收; 小的淌度(即大体积、低电荷离子)以降低所产生的电流。 那些被称为生物“优良缓冲液”的,如Tris, borate, CAPS等特别有用,因为这些缓冲溶液中的离子一般较大,能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流,但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。,常用的CE缓冲体系,磷酸钠体系 宽缓冲范围 硼酸钠体系 高pH范围 Tris-HCl体系 低pH范围 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系,CZE分离条件的选择,毛细管类型-涂层还是非涂层? 毛
5、细管长度-长毛细管还是短毛细管? 缓冲液体系-种类和pH值 添加剂类型-甲醇|环糊精|乙腈 检测器选择-紫外|二极管阵列|激光诱导荧光,缓冲溶液的选择,可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础,初步确定(最佳)pH范围后,再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一,它的紫外吸收低,pH缓冲范围比较宽(pH=1.513),但电导也比较大。,缓冲溶液及pH值的选择,研究经验表明:对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品,采用酸性(pH 2)或碱性(pH9)分离条件,比较容易得到好的分离结果;糖类样品通常在pH=911之间能获得最佳分离;羧酸或其他样品多在pH=59之间选择分离条件。,缓
6、冲溶液及pH值的选择,pH 的选择也和所用的毛细管种类有关,许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作,例如聚丙烯酰胺涂层毛细管,在3pH8的范围以外工作,其涂层容易水解失效。,缓冲溶液及pH值的选择,在相同的 pH下,不同缓冲体系的分离效果不尽相同,有的可能相差甚远。一般的经验是,能与样品发生相互作用的试剂,有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是,在分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系,因为硼酸根能与糖羟基形成配位键,从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。,缓冲溶液及pH值的选择,缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控
7、制在10200 mmol/L之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等,其浓度多控制在20 mmol/L附近,而电导小的试剂如硼酸及HEPES等,其浓度可在100 mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的,可采用很高(0.5mol/L)的试剂浓度,此时要注意减少分离电压,分析速度自然也将随之降低。,添加剂的选择,目的: 改善分离 抑制分析物在毛细管上的吸附,添加剂的选择,甲醇|乙腈(5-50%) 降低电渗流,增加分离有效距离,从而改善分离效果 增加非极性物质的水溶性 环糊精|SDS等表面活性剂 增加分离选择性,提高分析效果 降低电渗流,增加分离有效距离,从而改善分离效果 非极性高分子聚
8、合物 掩蔽毛细管内壁电荷,抑制分子吸附 降低电渗流 形成一定的分子筛,提高分子大小选择性,第二章 毛细管胶束电动色谱,电解质中加入表面活性剂(surfactant,例如SDS),使之形成胶束(Micelle),样品根据其疏水性(Hydrophobicity)强弱的差异,在胶束与电解质的分配系数有所不同來进行分离 ,样品疏水性愈強,则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后,泳动的速度会变慢,因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。,毛细管胶束电动色谱原理,Micellar Electrokinetic Chromatography (MEKC),七种青霉素的分离,CZE : 20mM Pi-Borate
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 毛细管 电泳 原理 分析 策略 CE
链接地址:https://www.31doc.com/p-3335722.html