青海大黄油菜粒色性状分子标记的开发和图谱整合.pdf
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1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(6): 965972 http:/zwxb.chinacrops.org/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: 本研究由国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2011AA10A104), 国家重点基础研究发展计划(973 计划)项目(2012CB723007), 国 家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-13)和国家自然科学基金项目(31060196)资助。 通讯作者(Corresponding author): 杜德志, E-mail: , Tel: 0971-5366
2、520 第一作者联系方式: E-mail: , Tel: 13639767407 (赵会彦); E-mail: (肖麓) 同等贡献(Contributed equally to this work) Received(收稿日期): 2013-08-21; Accepted(接受日期): 2014-03-04; Published online(网络出版日期): 2014-04-08. URL: http:/ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00965 青海大黄油菜粒色性状分子标记的开发和图谱整合 赵会彦* 肖 麓* 赵 志 杜德志* 青海大学农林科学院春油菜研究所 /
3、 青海省春油菜遗传改良重点实验室 / 青海省高原作物种质资源创新与利用国家重点实验室培 育基地, 青海西宁 810016 摘 要: 利用青海大黄油菜和褐籽白菜型油菜 09A-126 构建 BC4和 F2分离群体, 结合 AFLP 与群体分离分析法 (bulked segregant analysis, BSA)筛选引物, 获得 5 个与黄籽基因 Brsc1 紧密连锁的分子标记 Y11Y15。5 个 AFLP 特 异片段的序列, 均与白菜型油菜的 A9 染色体部分序列表现同源。将 5 个 AFLP 标记成功转化为 5 个 SCAR 标记 (SC11SC15)。 利用目标基因所在染色体区段序列筛选
4、到 7 个与目标基因紧密连锁的 SSR 标记(BrID10607、 KS10760、 B089L03-3 和 A1A4)。利用 SCAR 和 SSR 标记扫描 F2群体中部分单株, 发现 SC14 和 A1 为共显性标记。用 BC4群 体将 Brsc1 定位在标记 Y06 和 A4 之间 1.7 Mb 的区间内, 遗传距离分别为 0.115 cM 和 0.980 cM。标记 Y05 和 Y12 与 Brsc1 共分离。本研究为黄籽油菜分子标记辅助选择育种体系的建立及目标基因的进一步精细定位和图位克隆奠 定了基础。 关键词: 白菜型油菜; 黄籽; 分子标记; 遗传图谱; 物理图谱 Develop
5、ment of Molecular Markers and Map Integration for Seed Color Traits in Dahuang Rape (Brassica rapa L.) ZHAO Hui-Yan*, XIAO Lu*, ZHAO Zhi, and DU De-Zhi* Institute of Spring Rapeseed, Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Key Laboratory of Qinghai Province for Spring Rapeseed Genetic
6、 Improvement / National Key Laboratory Breeding Base of Qinghai Province for Innovation and Utilization of Plateau Crop Germplasm, Xining 810016, China Abstract: A BC4 population and a F2 population, derived from the cross between Dahuang and 09A-126 (brown seed, B. rapa), were constructed. AFLP (am
7、plified fragment length polymorphism) methodology and bulked segregant analysis (BSA) were used to get five AFLP markers closely linked to yellow-seeded gene Brsc1, termed Y11Y15 respectively. Five AFLP specific frag- ments were homologue with some sequences on chromosome A09 of Brassica rapa, which
8、 we converted into five SCAR markers, termed SC11SC15. Seven SSR markers, BrID10607, KS10760, B089L03-3, A1A4, tightly linked to Brsc1 were developed in the region of chromosome where Brsc1 was located. With five SCAR markers and seven SSR markers used for genotyping in F2 population, SC14 and A1 we
9、re confirmed as co-dominant markers. Using BC4 population, Brsc1 was located in the region of 1.7 Mb between Y06 and A04 on chromosome A9 with genetic distances of 0.115 cM and 0.980 cM. Y05 and Y12 co-segregated with Brsc1. The results were useful for developing yellow-seeded rapeseed lines by mark
10、er-assisted selection (MAS), and also laying the foundation for fine mapping and map-based cloning of Brsc1. Keywords: Brassica rapa L.; Yellow seed; Molecular marker; Genetic map; Physical map 油菜菜籽油是我国食用油的重要来源, 菜籽饼 粕是良好的蛋白质饲料, 提高含油量和蛋白质含量 是油菜品质育种的最重要目标。大量研究表明, 相 同遗传背景下, 黄籽油菜的籽油含量和蛋白质含量 通常高于黑籽或褐籽油菜,
11、 而且黄籽具有种皮薄、 纤维素和多酚类物质含量低、 油质清澈透亮等优点, 966 作 物 学 报 第 40 卷 因此, 黄籽油菜的选育倍受研究人员的重视1-4。 Mohammad 等5研究表明, 黄籽沙逊油菜黄籽性状 受 3 对基因(Br1、Br2 和 Br3)控制, 3 对基因同时为 隐性时表现黄籽, Jnsson6研究得出同样的结论; Stringam7研究表明, 黄籽沙逊菜籽种皮颜色受 2 对独立基因(Br1 和 Br3)控制, 当 2 对基因同时为 隐性时, 种皮颜色为黄色; Zaman8和 Rahman9同 样认为黄籽性状受双基因控制; Ahmed 和 Zuberi10 研究认为白菜
12、型油菜的黄籽性状受 1 对基因控制, Hawk11和 Chen 等12的研究与之相同; Schwetka13 认为白菜型油菜的粒色性状受母本影响较大, 且与 7 对基因(Br1、 Br3Br8)有关。 Teutonico 和 Osborn14 构建了白菜型油菜 RFLP 标记遗传连锁图谱, 将控 制黄籽和褐籽性状的位点 Yls 定位于第 5 连锁群; Chen 等15利用白菜型油菜-芥蓝单体异附加系筛选 到一个与种皮颜色基因紧密连锁的 RAPD 标记, 并 推测由于同源重组或染色体缺失, 该粒色基因位于 外来的 C 基因组第一条染色体的末端; Rahman 等16 利用黄籽沙逊为材料, 筛选到
13、一个与粒色基因 (Br1/br1)紧密连锁的 SRAP 标记 SA7BG29-245, 遗 传距离为 0.47 cM, 并将该标记转化为 SNP 标记和 SCAR 标记。 白菜型黄籽油菜是自然界存在的天然黄籽资源 之一, 白菜型油菜的黄籽性状的研究对甘蓝型黄籽 油菜品种的遗传改良具有一定的指导意义。青海大 黄油菜是起源于青藏高原的地方品种, 属白菜型油 菜, 菜籽种皮颜色鲜黄且遗传稳定, 自交亲和性好, 是进行油菜黄籽性状研究的良好材料17。Xiao 等18 认为黄籽性状受一个隐形基因位点(Brsc1)控制, 构 建了 Brsc1 的遗传连锁图谱, 并定位于白菜型油菜 A9 染色体上, 将目标
14、基因锁定 2.8 Mb 的区间。 本研 究扩大作图分离群体, 利用新的引物组合, 以筛选 更多与目标基因紧密连锁的分子标记, 与前人所获 得标记进行整合, 构建高密度的遗传连锁图谱, 为 黄籽油菜分子标记辅助选择育种体系的建立和图位 克隆奠定基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料和群体构建 选用亲本材料为青海大黄油菜(黄籽)和 09A- 126 (褐籽), 由青海省农林科学院春油菜研究所提 供。大黄油菜和 09A-126 均已连续自交或兄妹交 8 代以上, 粒色性状稳定。 以 09A-126 为供体亲本, 大 黄油菜为轮回亲本, 进行连续回交。在 BC1、BC2 和 BC3世代中均保留褐籽单
15、株上收获的种子播种, 用于下一轮的回交, 获得的 BC4分离群体作为 Brsc1 基因的定位群体; 大黄油菜和 09A-126 杂交获得的 F1单株自交, 获得 F2群体, F2中每一个单株套袋自 交, 获得 F2:3家系, 用于 F2单株基因型的鉴定。 1.2 DNA 提取和性状调查分组 在苗期, 从 BC4群体和 F2群体每株油菜中取适 量叶片, 采用 CTAB 法提取总 DNA, 参考 Doyle19 的方法并略作改动。使用紫外分光光度计测定每个 单株总 DNA 浓度, 稀释至 50 ng L1, 冷藏备用。 在角果完全成熟后, 采用目测法调查 BC4群体、 F2群体及 F2:3家系所有
16、单株种皮颜色。根据粒色将 BC4群体所有单株 DNA 分为黄籽和褐籽两组; 根据 F2群体单株粒色性状和 F2:3家系中粒色性状是否分 离将 F2群体单株 DNA 分为黄籽、 纯合褐籽(不分离) 和杂合褐籽(分离) 3 组。 1.3 AFLP 分析 在 BC4群体中随机挑选 12 个黄籽单株和 12 个 褐籽单株, 每 6 个单株 DNA 等量混合, 分别构建 2 个黄籽基因池和 2 个褐籽基因池。采用 Pst I/Mse I 的酶切组合, 首先利用 256 对选扩引物(P0116/MG01 16)和4个基因池筛选标记, 用6%聚丙烯酰胺凝胶电 泳检测 PCR 扩增产物。能区分黄籽和褐籽基因池
17、的 多态性标记继续用 BC4分离群体单株检测, 最终筛 选出与粒色性状紧密连锁的 AFLP 标记20-21。参照 陆光远22的方法操作。AFLP 引物由上海生工生物 工程有限公司合成。 1.4 AFLP 特异片段回收、测序及序列比对 在 6%聚丙烯酰胺凝胶胶板干燥之前将 AFLP特 异片段用刀片轻轻挖出并转入 0.5 mL 离心管中, 加 2040 L ddH2O, 沸水浴 10 min 后取上清液利用原 引物重新扩增, 用 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物, 用 Sanprep 柱式 DNA 胶回收试剂盒(上海生工生物 工程有限公司)从琼脂糖胶块中回收目标片段。将目 标片段与 pMD18-T
18、载体(大连宝生物工程有限公司) 连接, 导入 DH5 大肠杆菌感受态细胞克隆扩增, 经蓝白斑筛选和电泳检测, 从每个目标片段挑选 3 个阳性克隆菌液, 送上海生工测序。具体操作参照 易斌23的方法。 测序后, 在 BRAD 数据库(http:/brassicadb.org/ brad/index.php)和 TAIR 数据库(http:/www.arabido- psis.org/)中, 使用 Blast 命令分析每个 AFLP 特异片 第6期 赵会彦等: 青海大黄油菜粒色性状分子标记的开发和图谱整合 967 段与白菜型油菜基因组和拟南芥基因组的序列共线 性, 确定每个特异片段所在染色体及在染
19、色体上的 物理位置24-26。 1.5 SCAR 标记转化 根据 AFLP 特异片段的序列信息, 利用 Primer3 软件(http:/frodo.wi.mit.edu/)设计 SCAR 引物, 由上 海生工生物工程有限公司合成。首先在基因池和 BC4分离群体部分单株中检测合成后的 SCAR 引物 是否具有多态性, 然后在 F2群体中用黄籽、杂合褐 籽和纯合褐籽的单株检测其是否为共显性标记。参 照李霞27的方法进行 SCAR 引物 PCR。 1.6 SSR 分析 根据 Xiao 等18对目标基因的定位结果及本研 究 AFLP 分析比对结果, 从 BRAD 数据库下载目标 基因所在区域内的已公
20、布的 SSR 标记, 并下载相关 区段 DNA 序列, 用 SSRHunter 1.3 软件检测 SSR 位 点, 用 Primer3 软件设计 SSR 引物。 参照 Cheng 等28 的 PCR 体系, 检测方法与 SCAR 引物检测方法相同, 见 1.5。 1.7 图谱构建和绘制 利用 BC4群体所有单株检测特异性 AFLP 和 SSR 标记, 筛选交换单株, 计算重组率, 用 Kosambi 函数将重组率转换为遗传距离29。 用 MapMaker/Exp 3.0 软件分析标记与目标基因之间的连锁关系, 构建 目标基因所在染色体局部区域的遗传连锁图谱30。 连锁标记在染色体上的物理位置可
21、由 BRAD 数据库 获得。用 MapDraw Ver. 2.1 软件绘制遗传连锁图谱 和连锁标记的物理图谱31。 2 结果与分析 2.1 AFLP 分析 利用4个基因池检测 AFLP 引物, 若多态性片段 同时出现在2个褐籽基因池中, 而在2个黄籽基因池 中都缺失, 则认为可能与目标基因连锁。将这些引物 组合挑出, 用于分析 BC4群体中随机挑选的6个黄籽 单株和6个褐籽单株。部分标记, 尤其是在基因池检 测中多态性条带较弱的标记, 在进行单株检测时多 态性消失; 部分标记检测出的重组单株大于2株, 说 明离目标基因较远, 同样予以舍弃。特异条带清晰且 检测出的重组单株少于2株(包含2株)的
22、 AFLP 标记, 被认为是与目标基因紧密连锁的 AFLP 标记。 本研究 中, 共筛选256对引物组合, 获得5个与目标基因紧密 连锁的标记, 将其分别命名为 Y11Y15 (表1)。 2.2 AFLP 特异片段同源性分析 5 个 AFLP 特异片段经回收、克隆和测序, 序列 信息提交 BRAD数据库序列比对表明, 5个特异片段 均与白菜型油菜 A9 染色体序列高度同源, 与 Xiao 等定位结果一致, 进一步证实控制粒色性状的基因 位于 A9 染色体上; 5 个 AFLP 特异片段的序列信息 同时提交 TAIR 网站序列比对表明, Y11 和 Y15 标记 分别与拟南芥第 5 染色体和第
23、2 染色体部分序列同 源(表 1)。 2.3 SCAR 标记转化 根据5个AFLP特异片段的序列信息, 在靠近特 异片段序列末端区域设计 SCAR 引物, 每个 AFLP 特异片段设计一对 SCAR 引物, 分别命名为 SC11 表 1 与 Brsc1 紧密连锁的 AFLP 标记 Table 1 AFLP markers closely linked to Brsc1 标记名称 Marker 引物序列 Primer 特异片段 Specific fragment (bp) 白菜型油菜连锁群 Linkage group of B. rapa (position) 白菜型油菜 同源基因 Orthol
24、ogous gene on B. rapa 遗传距离 Genetic distance (cM) 拟南芥连锁群 Linkage group of A. thaliana (position) 拟南芥同源基因 Orthologous gene on Arabidopsis Y11 P-GCA/M-GAG 144 A9 (13, 623, 148-13, 622, 882) Bra027520 Chr5 (17, 709, 027-17, 709, 261) AT5G44010 Y12 P-GGT/M-GAA 120 A9 (16, 472, 257-16, 472, 371) 0 Y13 P-T
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