龙山卷丹百合无症病毒的检测.pdf
《龙山卷丹百合无症病毒的检测.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《龙山卷丹百合无症病毒的检测.pdf(4页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、卷丹百合是湖南省一种具有浓郁地方特色的 农产品, 不仅具备食用和药用双重价值, 还有较强 的观赏价值, 主要分布于湘西州龙山县、 邵阳市隆 回县和永州市东安县,其中以龙山县栽培历史最 为久远, 在省内外享有很高的知名度, 食用百合生 产已经成为当地农户致富的特色创收项目之一。 但长期以来,由于百合种球生产主要靠扦插和分 球等无性繁殖方式进行, 病毒感染严重, 导致产量 和质量下降, 产区出现百合植株的黄化、 皱缩和畸 形等衰退现象,给食用百合产业带来巨大的经济 损失, 严重影响农户的生产积极性。 到目前为止,已相继报道对百合具有侵染性 的病毒达 10 种以上,其中危害较为严重的有 3 种: 百
2、合无症病毒 (LSV) 、 黄瓜花叶病毒、 郁金香 碎锦病毒 1-4。百合无症病毒属于线性病毒科、 香 石竹潜隐病毒属, 是分布范围最广、 危害最大的病 毒之一5, 主要通过汁液传播, 也可以通过叶片接 触或昆虫媒介的方式传播。由于单独侵染百合时 常使寄主表现为隐症, 故称为百合无症病毒; 与其 它病毒复合侵染时, 会出现脉明、 畸形、 坏死斑等 症状6-9。 近年来, 国内外对侵染百合的 LSV 有 较多的研究报道10-13, 但关于湖南龙山卷丹百合 感染 LSV 的报道尚少。本研究通过对湖南龙山卷 丹百合实地调查,采回病样,采用血清学和 RT- PCR 法对卷丹百合感染 LSV 的情况进行
3、检测和 鉴定, 旨在为湖南龙山卷丹百合病毒检测、 病毒病 的防治和无毒苗的培育提供技术支撑。 1材料和方法 1.1DAS-ELISA 检测法 1.1.1材 料 卷丹百合样品于 2012 年 7 月采自湖南省湘西 州龙山县百合产区, 田间感病株呈现出叶脉黄化, 收稿日期:2014-02-19;修订日期:2014-03-10 基金项目:湖南省科技厅项目 (2013NK3043) ; 湖南省自然基金 (11JJ6022) 作者简介:蒋辉 (1972) , 男, 湖南怀化人, 实验师, 主要从事园艺植物栽培生理研究。 植物生理与生物技术 龙山卷丹百合无症病毒的检测 蒋 辉, 源朝政, 陈海霞 (湖南农
4、业大学 园艺园林学院, 湖南 长沙 410128) 摘要: 以龙山卷丹百合的病叶作为试材, 采用 D A S - E L I S A S检测法对样品进行百合无症病毒的检测, 检出率为 5 8 . 3 %; 提取总 R N A为模板, 通过 R T - P C R扩增其外壳蛋白基因, 大小为 2 8 7b p , 和预期条带大小一致。经 B l a s t 比对发现, 该基 因片段与 G e n b a n k上发表的 L S VC P基因序列同源性达 9 2 %以上。 关键词:卷丹百合; R T - P C R ; D A S - E L I S A ; 百合无症病毒 中图分类号:S682.2
5、文献标识码:ADOI编码:10.3969/j.issn.10066500.2014.05.006 Detection of LSV Infecting Longshan Lilium tigrinum JIANG Hui, YUAN Chao-zheng, CHEN Hai-xia (College of Horticulture and Landscape, Hunan Agriculture University, Changsha, Hunan 410128, China) Abstrat: In this research, Lilium tigrinum of longshan wa
6、s used as experimental material to be studied for virus detection. The re- sult of DAS-ELISAS showed that the positive rate of LSV was 58.3%. Total RNA used as template, the coat protein gene by RT- PCR amplification size was 287 bp, the same as expected. By the Blast, the homology of this gene frag
7、ment and the LSV CP gene sequence that published in Genbank was more than 92%. Key words: Lilium tigrinum; RTPCR; DASELISA; LSV 2014,20(5):27-30天津农业科学 Tianjin Agricultural Sciences 天津农业科学第 20 卷 部分叶片卷曲, 植株矮缩束顶的不正常生长现象。 阳性对照 (含 LSV 病毒样品)和阴性对照 (不含 LSV 病毒样品) 均购自上海卡奴生物科技有限公 司的 LSV DAS-ELISA 检测试剂盒。 1.1.2方
8、 法称取 0.5 g 新鲜百合病叶置于研钵 中, 加入液氮充分研磨, 并转移到装有 200 L 裂 解液的 1.5 mL 离心管中, 匀浆; 4 , 15 000 g, 离 心 5 min, 弃沉淀, -20 保存上清。病毒检测方法 参照试剂盒操作步骤进行。 1.1.3判断标准酶标仪在 450 nm 处读取吸收 值 (OD 值) 。结果判断标准为: 临界值 (CO) =阴性 对照均值+0.15, 样品 OD 值临界值, 为百合无症 病毒 (LSV) 阳性。 1.2RT-PCR 检测法 1.2.1材料及主要试剂以 DAS-ELISA 方法检 测呈现阳性的百合病叶为试材,进一步进行百合 无症病毒的
9、分子检测。 cDNA 第一链合成试剂盒购自北京天根生物科 技有限公司; 植物类病毒 RNA 核酸提取试剂盒购自 武汉哇哇噻纳技术开发有限公司; RT-PCR 反应所 采用的试剂 High dNTPs、 10PCR Buffer、 Taq DNA 多聚酶则购于上海生工生物工程有限公司; DNA 凝 胶纯化回收试剂盒购自 Vigene Biotech 公司。 1.2.2引物设计 与 合 成根据 NCBI 已发表的 LSV 病毒的 CP 基因序列, 设计特异性引物: 上游 引物 p1: 5-ACGCTGGACTGCGGA-3,下游引物 p2:3-AAGCCAAAGGTCCGAGGG-5, 引物由上海
10、 生工生物工程有限公司合成。 1.2.3总RNA的提取称取 0.5 g 新鲜的百合 病叶, 放置于已灭菌的研钵中, 加入液氮迅速研成 粉末,转移到加有 200 L 裂解液的 1.5 mL 去 RNA 酶的离心管中,匀浆,室温静置 5 min; 4 ,15 000 g, 离心 15 min, 取上清液。 另取 1.5 mL 离心管, 依次加入 150 LBinding buffer, 50 L 上清, 20 L 纳米磁珠 (MNP) , 混匀; 70 恒温, 预热 10 min, 每 23 min 混匀一次; 短 时高速离心, 去上清; 加入 200 Lwashing buffer I, 充分混
11、匀, 去上清; 加入 200 L washing buffer II, 充分混匀, 去上清; 加入 200 L washing buffer III, 充分混匀, 去上清; 最后加入 50 L Elution buffer, 静置 3 min, -80 冰箱保存上清。然后加 DNA 消 化酶去除 DNA 的干扰,通过 1%琼脂凝胶和溴化 乙锭 (EB) 染色后, 进行电泳检测15。 1.2.4cDNA第一链的合成提取卷丹百合病 叶的 RNA,按照天根公司 cDNA 第一链合成试剂 盒说明书操作步骤合成 cDNA。在 20 L 反应体 系中: 5gDNA Buffer 2 L, Total RN
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 龙山 百合 病毒 检测
链接地址:https://www.31doc.com/p-3336086.html