流式细胞术的样品制备.ppt
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1、流式细胞术的样品制备,FCM的样品制备包括单分散细胞悬液制备技术,细胞生物学特征标记技术及荧光染色技术,FCM是对细胞或细胞器的结构和某些功能进行定量测定,并可以根据细胞亚群的特点性质对其进行分类的技术。 FCM的实验对象是单细胞或单细胞核的悬液,在FCM技术中制备出合格的单细胞悬液是非常重要的环节,这些单细胞悬液主要来源于单层细胞、血液、脱落细胞、实体组织及石蜡包埋组织等。,一、单层培养细胞分散为单个细胞 贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备 操作步骤: 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。 2、加入少量0.25%胰酶,消化细胞,在倒置显微镜下观察,见细胞稍变圆时,立即终止消化(
2、假如含有10%胎牛血清的培养基),收集细胞,离心后去上清,PBS液洗涤细胞一次,离心去掉上清液,约留0.5ml细胞悬液,用振荡器使细胞分散。 3、如果不是及时上机检测,则需要对细胞进行固定,常规固定液为70%乙醇,然后保存于4冰箱中。,(二)悬浮培养细胞单细胞悬液的制备 操作步骤: 1、离心去除旧培养液,PBS液洗涤细胞一次,离心去掉上清液,约留0.5ml细胞悬液,用振荡器使细胞分散。 2、如果不是及时上机检测,则需要对细胞进行固定,常规固定液为70%乙醇,然后保存于4冰箱中。,二、实体组织单分散细胞的制备 新鲜实体组织 新鲜实体组织是手术或活检后根据检测目的而采取的样品,此样品应及时进行适当
3、的保存处理,如及时用固定剂或低温对组织进行保存,以避免由于室温过高、放置时间过长而造成组织自溶,影响检测结果。,新鲜实体组织单细胞悬液制备方法如下: 酶消化法 机械法 剪碎法 网搓法 研磨法 化学试剂处理法,酶消化法 酶对实体组织分散作用原理主要有三方面: 一是可以破坏组织间的胶原。 二是可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质。 三是可以水解组织间的粘多糖物质。 酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法,常用的酶类试剂有: 蛋白酶类,(如胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,链蛋白酶和中性蛋白酶等)都能够释放所有组织中的细胞; 胰酶,能水解脂键和肽键; 胶原酶,能降解几种分子类型的胶原; 溶菌酶,能水解糖
4、蛋白和肽的糖苷键; 弹性蛋白酶,能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维,可用于解离血管、心脏和肝脏的细胞。,为使组织细胞分散下来,应用酶学方法必须注意条件的选择和影响因素: 酶需要溶解于适当的溶液中,而这种溶液不致于造成 酶效价降低 注意组织在消化液中的消化时间 注意酶活性的PH值 注意酶的适用浓度 随时注意影响酶活性的其他因素 各种酶的分散程度都有一定的限制性,特别是在进行免疫标记实验时,酶处理可能改变细胞膜的成分,从而影响细胞亚群的区分。应指出,用于组织分散的很多酶是不够纯的,不仅含有一种占主导的酶,而且在不同程度上也混有其他污染物质,它们的活性可能有利于组织分散,也可能对组织的结构或功能
5、产生不利的影响。,酶学方法的一般程序: 将适合于酶消化的组织置于离心管中。 将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中。 一般消化20-30分钟(恒温37C或室温),消化期间要间接振荡或吹打。 终止消化,收集细胞悬液,以尼龙网(200目)过滤,除去大团块,以低速离心除去细胞碎片。 将制备好的单细胞进行流式细胞术分析或保存。,机械法 机械法分裂实体组织包括:用剪刀剪碎或用锋利的解剖刀剁碎,用匀浆器匀浆,用细注射针头抽吸细胞以分散细胞,采用网搓法同样也能获得大量的细胞,机械法易造成细胞悬液中细胞碎片,所以机械法常与其他方法配合使用。,常用的几种机械法制备过程如下: 剪碎法: 将组织块放入平
6、皿中,加入少量的盐水。 用剪刀将组织剪至匀浆状。 加入10ml生理盐水。 用吸管吸取组织匀浆,先以100目尼龙网过滤到试管中。 离心沉淀1000prm3-5分钟,再用生理盐水洗三次,每次以短时低速离心沉淀(500-800prm)去除细胞碎片。 以300目尼龙网过滤除去细胞团块。 70%冰乙醇固定,放入4冰箱。,网搓法: 将100目铜网扎在小烧杯上。 把剪碎的组织放在网上,以眼科镊子轻轻搓组织块,边搓边用生理盐水冲洗,直到将组织搓完。 用300目的尼龙网过滤细胞悬液除去大的团块 收集细胞悬液,离心沉淀1000prm,5分钟。 70%乙醇固定,置4冰箱备用。,研磨法 准备一只70ml组织研磨器 将
7、组织剪碎至小块。 放入组织研磨器中,加入1-2ml生理盐水。 转动研棒,研至匀浆即可。 加入生理盐水10-20ml,冲洗研器。 收集细胞悬液,并经300目尼龙网过滤,离心沉淀500-800prm,1-2分钟,再用生理盐水洗三次,离心沉淀。,化学试剂处理法 化学试剂处理法的主要原理是将细胞间起粘连作用 的钙镁离子置换出来,从而使细胞分散下来。 试剂配制: 0.2%EDTA配制 EDTA0.2g溶解后,加入Hanks液100ml,封装高压消毒,置0-4保存。 胰酶加EDTA配制 胰酶0.25g+PBS(PH7.0)200ml,浓度0.125%,EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml,浓度
8、0.2%。 各取40ml混合,分装置冰箱保存,用时过滤既可。,实验步骤: 将组织切成薄片放入试管。 加入EDTA液5ml,室温,半小时,弃之。 加入胰酶+EDTA液5-10ml,在37恒温水浴30分钟,间断振荡3-5次。 用300目尼龙网过滤,离心沉淀1000prm,5分钟,再以生理盐水洗2-3次,离心500-800prm,1-2分钟。 70%乙醇固定置冰箱中被检。,实验证实,用化学试剂处理组织导致细胞成活率降低,细胞产额较低,细胞碎片和细胞丛结的量不稳定,因此,化学试剂处理方法不单独使用,可与其他方法联合使用。 机械法常常造成严重的细胞损伤,较低的细胞产量,为使细胞碎片不影响FCM检测结果,
9、需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。 酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的,但是会对所测化学成分造成不良影响,所以根据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法,才能获得理想的样品和更好的FCM结果。,注意事项: 新鲜组织标本应及时进行保存,以免组织在室温下放置时间过长,造成细胞自溶导致DNA降解,影响FCM测定结果。 根据实验目的选用最佳的细胞固定方法,以免由于固定剂的原因,造成FCM检测结果的不稳定。 酶学法要注意条件的选择和影响因素,要注意酶的溶剂,消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。 需注意不同的组织选用适当的方法,如富于细胞的肿瘤(淋巴瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化癌、髓
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