Ⅳ 酶的提取与分离纯化.ppt
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1、 酶的提取与分离纯化,重点,一 酶的下游加工流程,1.预处理 2.细胞过滤分离 3.酶提取 4.酶分离纯化 5.酶浓缩、结晶、干燥 6.酶保存 7.酶制剂成型 酶工程下游技术操作条件,二 预处理,1.加热:使温度达到最适温度 2.凝聚,絮凝 3.加酸碱:达到最适PH,三 细胞过滤分离,1.细胞破碎法 机械破碎法:研磨、搅拌、匀浆 物理破碎法:温度差法、压力差法、超声 波空穴效应 化学破碎法:酸碱,有机溶剂破坏细胞壁、膜 酶破碎法:加酶破坏细胞壁、膜;最适条件培 养,使溶酶体破裂自溶 2.过滤方法:加压、常压、减压过滤法 空穴效应:超声波使发酵液中产生许多小气泡, 气泡破裂产生内爆力使细胞破碎,
2、四 酶提取,1.本质:使胞内酶溶解到发酵液中,使酶出 细胞 2.方法:盐溶法,有机溶剂溶解法,PH远离 PI 3.条件:T:0oC-10oC PH:酶活力范围内,远离PI 提取液体积:酶液体积的2-5倍,酶工程下游技术操作条件,T:0-10oC低温 PH:根据要求,远离或趋近PI 加酶活保护剂:有机溶剂提取、沉淀分离时 防酶失活,五 酶的分离纯化,沉淀分离 膜分离 离心分离 层析分离 电泳分离 等电点分离,沉淀分离,一 盐析法 1.原理:高浓度(NH4)2SO4中和蛋白质表面电 荷,使同电相斥作用减小凝聚沉淀 2.,二 等电点法沉淀分离,1.原理:PH=PI时,带电量为零,同电相斥作用 最小,
3、凝聚沉淀 2.注意:等电点法不破坏水膜,不一定沉 淀,须与其他方法联合使用,三 有机溶剂沉淀法,1.原理:有机溶剂破坏蛋白质三级结构,使非 极性基团外露,极性基团内藏,使水膜 破坏,凝聚沉淀.,膜分离法,一 压差膜法 1.纳滤: 2.微滤: 3.超滤:,二 电位差膜法(电渗法),1.定义:用两块膜把水槽分为三个室,加空 间电场,使中间室中待分离液中正、 负离子分别电渗到两边的两室 2.注意:正离子向靠近负极的室电渗 负离子向靠近正极的室电渗,三 扩散膜法,1.定义:将待分离液装入膜袋中,膜袋外为 浓度大于或小于待分离液的溶液。 利用浓度差使待分离液中水、杂质 通过渗透或渗析而与需要的组分分 离
4、 2.渗透与渗析 渗透:只有溶剂透过膜 渗析:有溶质透过膜,四 膜的选择,1.透水率: 2.截留率: 3.截留物相对分子量:,离心分离,一 离心机的选择 1.常速离心机:Vmax8000r/min; 用于: 2.高速离心机:Vmax(1-2.5)104r/min; 用于: 3.超速离心机:Vmax(2.5-12)104r/min; 用于:生物大分子、,二 离心方法,1.差速离心法:利用密度(质量数)不同的 物质离心速度不同而分离 密度大的物质在离心瓶底部 ,密度小的在上部 2.密度梯度离心法:,3.等密度离心法:,层析分离,一 吸附层析 1.原理:利用各物质在同种吸附剂中扩散速 度不同而分离
5、2.常用吸附剂:,二 分配层析,1.原理:利用吸附剂与载体的共同作用,各 物质扩散速度不同而分离,比吸附 层析效果好 2.三类:滤纸层析 ,三 离子交换层析,1.原理:利用离子交换剂上柱,以离子键与待分离物结合,再水洗掉杂质,洗脱剂洗脱待分离物,从而得到待分离物,离子键结合稳,效果好 2.几个重要的离子交换剂: 3.几个重要的洗脱剂: 离子交换剂: 阴离子交换剂:带正电的物质,可吸附阴离子 阳离子交换剂:带负电的物质,可吸附阳离子,层析基本操作过程,四 凝胶层析,1.原理:待分离液与凝胶溶液混合上柱,利 用大分子太大,不从凝胶网孔通过 ,而是从凝胶粒子间通过,受阻力 小,沉降快,而小分子小,可
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