目的基因的制备.ppt
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1、2019/8/14,1,第五章 目的基因的制备,第一节 目的基因的制备 第二节 目的基因的分离,2019/8/14,2,一 概 述,基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。,目的基因,确定其表达调控机制和生物学功能,建立高效表达系统,构建具有经济价值的基因工程菌(细胞),体外进行必要的结构功能修饰,输回细胞内改良生物体遗传性状,包括人体基因治疗,2019/8/14,3,二 什么是目的基因,基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中,创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中,根据需要分离出此类基因,即准备要分离、改造、扩增或表
2、达的基因通常称之为目的基因。 如抗逆性相关基因(抗病、抗寒等)、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因 、工业用酶等相关基因等。,2019/8/14,4,一般来说,目的基因的制备战略分为两大类 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆; 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然后将之克隆表达。,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,5,第一节 目的基因的制备,1、直接法制备基因 2、从基因组文库中钓取目的基因 3、从cDNA文库中钓取目的基因 4、通过PCR直接扩增出目的
3、基因,2019/8/14,6,1.1 限制性核酸内切酶酶切分离法,限制性内切酶酶切分离法适于从简单基因组(如质粒和病毒)中分离目的基因。 对已定序的DNA分子,只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割,分离纯化所需DNA片段,与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。 对已知定位的目的基因,只要根据目的基因两侧的已知的限制性内切酶识别位点,用适当的限制性内切酶切割,一次就可获得目的基因。,2019/8/14,7,所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列,所以只要掌握了其分子结构,完全可以在实验室进行人工合成。 1977年,利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因(生
4、长激素释放因子基因),并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此,化学合成基因得到了很大的发展迅速。,早期通过化学合成的部分基因,基因 人胰岛素 转运RNA -干扰素 肠促胰液肽 尿抑胃激素 -干扰素,大小(bp) 126 542 81 162 453,合成年代 1978 1979 1981 1982 1982 1984,基因 视紫红质 前脑菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶T1 RNA酶,大小(bp) 1057 77 170 385 324 375,合成年代 1985 1985 1985 1985 1986 1987,1.2 化学法直接合成基因,2019/8/14,8,1.2.1.1小片段粘接法:,
5、混合退火,根据目的基因全序列,分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,1.2.1 化学合成法的基本战略,全基因合成有三种战略:,2019/8/14,9,混合退火,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow酶聚合,1.2.1.2 补钉延长法,根据目的基因两条互补链全序列,分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段,2019/8/14,10,根据目的基因的全序列,分别合成40-50碱基长的单链DNA片段,混合退火,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow酶聚合,1.2.1.3 大片段酶促法
6、,2019/8/14,11,1.2.1.4 三种方法各有利弊,化学合成DNA的单片段愈短,收率就愈高,但由于化学合成的份额较大,成本较高;在大片段酶促法合成目的基因时,虽然化学合成的份额相对较小,成本较低,但大片段化学合成的收率极低,例如,每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%,2019/8/14,12,1.2.2 化学合成的单元操作,化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去,每接一个单体就是一个循环反应,包括:基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲,DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷
7、酸三酯法;具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐,基本上已淘汰;后者反应中间物的分离程序简便,DNA合成仪就是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的,2019/8/14,13,O,H,G,H,H,H,H,O,CH,2,O,DMT,P,O,Me,N,CH,Me,Me,CH,Me,Me,H,激活,缩合,氧化,脱取代基,玻璃珠,化学合成的单元操作,DMT: 二甲氧基三苯甲基,连接臂,2019/8/14,14,合成天然基因,修饰改造基因,设计新型基因,制备探针、引物、接头,1.2.3 DNA化学合成的用途,如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等,如组织型纤溶酶原激活剂
8、基因、尿激酶原基因等,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,15,第一节 目的基因的制备,1 直接法制备基因 2 从基因组文库中钓取目的基因 3 从cDNA文库中钓取目的基因 4 利用PCR直接扩增出目的基因,2019/8/14,16,对于高等真核生物而言,基因组DNA庞大,组成结构复杂,存在间隔序列和重复序列,因此,单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小,大多数基因难以直接分离得到。 为了解决这个难题,可行的方法就是将这个基因扩增,增加成功分离目的基因的可能性。 但是由于要分离的目的基因往往是未知基因,因此无法对它进行特异性扩增,而只能对所有的基因进行扩增,也就是构建该生物材料的
9、基因组文库。然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来。,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,17,2、从基因组文库中钓取目的基因,2.1基因文库的构建 2.1.1基因文库的基本概念 基因库(gene pool):特定生物体全基因组的集合(天然存在) 基因文库(gene library or gene bank):从特定生物个体中分离的全部基因,这些基因以克隆的形式存在(人工构建)一个受体菌的群体之中 , 这个群体即为这种生物的基因文库。 根据构建方法的不同,基因文库分为:基因组文库(含有全部基因); cDNA文库(含有全部蛋白质编码的结构基因),2019/8/14,第一节 目的基因的制
10、备,18,2.1.2 基因文库构建的材料来源,材料来自染色体DNA或mRNA 在高度分化的生物体中,不同组织和细胞在不同时段的mRNA一般还有组织细胞的界定,如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然, cDNA文库的信息量远小于基因组文库种类不同(即基因的表达谱不同),因此同种生物体的cDNA文库,2019/8/14,19,2.1.3 基因文库的完备性,基因文库的完备性是指:在构建的基因文库中任一基因存在的概率,它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示: 其中:P=任一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率, f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小,N = ln ( 1
11、 P ) / ln ( 1 f ),例如,人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp,基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb,则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆;而当完备性提高到0.9999时,基因文库至少需要180万个克隆,2019/8/14,20,For example : 期望值为0.99,插入片断为20kb的 E.coli (4.6106 bp) 和 human (3109 bp) 基因组的克隆数的计算 N E.coli= =1.1 103,ln( 1-0.99),ln1-(2104/4.6106),Nhuman= = 6.9 105,ln(1-0.99),l
12、n1-(2 104/3 109),这个例子说明用质粒载体(插入片段5-10kb)就可以建立很好的原核生物基因文库,只需要几千个克隆;而真核生物则需要更大承载能力的载体。,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,21,2.1.4基因文库的质量标准,除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因文库应具备下列条件: 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选,2019/8/14,22,2.1.5基因文库的构建技术路线,材料的选择
13、及基因组DNA的制备; 载体的选择; 载体与基因组DNA的限制性酶切; 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞; 重组克隆的筛选和保存。,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,23,2.1.5.1 基因组DNA的制备,文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。 制备的DNA分子量越大,经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低,重组率和完备性也就越高,用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右。如果先将细胞固定在低融点凝胶中,然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡,可获得1000 kb大小的DNA片段,2019/8/14,第一节
14、目的基因的制备,24,2.1.5.2 载体的选择,出于压缩重组克隆的数量,用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒;对于大型基因组(如动植物和人类)需使用YAC或BAC载体。由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb,因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。上述几种载体的最大装载量如下:,l-DNA,质粒,考斯质粒,10 kb,23 kb,45 kb,BAC,300 kb,用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,25,2.1.5.3 载体与基因组DNA的切割,用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处
15、理和限制性内切酶部分酶切两种方法,其目的是: 第一 保证DNA片段之间存在部分重叠区。 第二 保证DNA片段大小均一。 超声波处理后的DNA片段呈平头末端,需加装人工接头。 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶,这样DNA酶解片段的大小可控。 连接前,上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离,以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体。,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,26,2.1.5.4 载体与外源片段的连接 (1) 连接酶,DNA连接酶;T4 DNA连接酶;E.coli DNA连接酶 它们都可以催化5末端磷酸和3末端羟基形成磷酸二酯键。 但由于T4 DNA连接
16、酶既能连接粘性末端还能连接平末端,而E.coli DNA连接酶主要连接粘性末端,所以一般连接反应中都用T4 DNA连接酶。,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,27,(2)连接反应的效率,连接反应的效率和连接产物的组成与DNA末端的特性、DNA末端的浓度以及所用的连接酶量有关。 平末端连接反应的效率相对较低,它需要较高浓度的平末端、较大的连接酶量、较低浓度的ATP以及不能有象亚精胺一类的多胺。 在连接反应中加入15的PEG 8000或11.5pmolL 氯化六氨合钴等浓缩剂可极大地促进平末端反应的连接速度,同时可改变不同连接产物的比例,使连接产物增多。,2019/8/14,第一节 目的
17、基因的制备,28,(3)避免外源DNA片段之间的连接措施,在基因组文库的构建过程中,最应引起重视的问题是:严禁外源DNA片段之间的连接! 为了避免上述情况的发生,可采取下列措施的组合: 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,29,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,30,2.1.5.5 重组DNA导入宿主及筛选,转化 转导 转染 感染 结合 其它,2019/8/14,31,密集铺板(1-10万),杂交,挖取,目的重组克隆,铺板,铺板,2019/8/1
18、4,第一节 目的基因的制备,32,构建噬菌体基因组文库的主要步骤,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,33,用粘粒载体建立基因组文库的主要步骤,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,34,2.1.5.6 基因组文库重组克隆的排序,大型基因文库(包括人的基因文库)的构建在技术上并不十分困难,如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时,一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。 然而基因文库的克隆都是随机序列,必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建,属于基因文库的后期制作,2019/8/14,第
19、一节 目的基因的制备,35,(1)酶切片段末端标记法,将单一的YAC克隆插入DNA片段用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段,末端标记同位素。 然后再用Sau3A I或Mbo I将末端标记的DNA片段降解成碎片,聚丙烯酰胺凝胶电泳,每10个YAC克隆走在同一块板上,形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱 电脑分析指纹图谱,如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同的,则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性,于是这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,36,H,H,H,H,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,
20、S,S,S,单一克隆指纹图谱,十克隆指纹图谱,载体DNA,克隆DNA,2019/8/14,第一节 目的基因的制备,37,(2)随机探针联合杂交法,将若干YAC克隆固定在薄膜上,并复制二十份薄膜;合成20种不同序列的短探针,其序列是随机的。 用20种探针随机定位杂交(一对一)20份YAC克隆薄膜。 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应,则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”,而阴性结果记为“0”,可清晰地列成一张表,最终排出上述YAC克隆的排列顺序 。,2019/8/14,38,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15
21、,16,17,18,19,20,A B C D E F G,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,2019/8/14,39,01,04,12,06,13,14,02,17,07,19,11,15,05,08,16,03,10,09,20,18,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1
22、,1,1,1,1,1,F,C,A,D,G,E,B,2019/8/14,40,(3)染色体走读法(chromosome walking),从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点,将之两端序列分别亚克隆,亚克隆片段在0.5 2.0 kb范围内 分别以上述亚克隆DNA片段为探针,杂交同一基因文库,杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针,进行第二步走读,直至线型染色体DNA的端点,2019/8/14,41,染色体走读法(chromosome walking),走读的起点克隆片段,亚克隆旁测序列,探针标记,第一轮杂交,阳性克隆,
23、阳性克隆,第二轮杂交,第二轮杂交,2019/8/14,42,染色体走读法(chromosome walking),走读的起点克隆片段,2019/8/14,43,2.1.5.7 从基因组文库中钓取目的基因,构建了基因文库仅仅是完成了基因克隆,并不等于完成了基因分离。构建成的文库仅是一个杂乱无章的“基因图书馆”,要想从中找到所需基因,必须有一些相关线索。分离目的基因也要知道与目的基因有关的某些或某个特征,才能据此找到相关基因。主要方法有: 核酸杂交方法; 免疫学检测方法; DNA同胞选择法(极少用); PCR筛选法; 其他方法。,2019/8/14,44,(1)核酸杂交方法,适用于大量筛选,常用,
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