结构生物学10.ppt
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1、第五章 基因组测序计划和结构基因组学,人类基因组计划 后基因组时期新的研究领域 结构基因组计划,人类基因组计划(HGP),“人类基因组计划”是人类自然科学史上最伟大的创举之一,它的规模可以与“曼哈顿”原子弹计划、“阿波罗”登月计划娘美,而它的意义又远超出了这两个计划。 HGP的由来 HGP的目标 HGP的主要内容 HGP的参与国与资金投入 HGP的进展和成就 人类基因组研究的应用 人类基因组研究引发的社会和伦理问题,人类基因组计划的由来,上世纪70年代的“基因论”是人类基因组计划的科学背景 所有的疾病都与人类的基因相关,都是人类基因组与病原基因组中有关基因相互作用的结果。 不仅疾病与基因有关,
2、人的出生、成长都与基因有关,都与DNA的序列有关。 著名的诺贝尔奖获得者杜伯克在他发表的一篇文章,后来被称为“人类基因组计划”的“标书”之中写道:人类的DNA序列是人类的真谛。这个世界上的发生的一切,都与之息息相关。 在策略上说,“人类基因组计划”所采取的策略是“基因组学”的策略 杜伯克说:既然大家都知道基因的重要性,那我们就只有两种选择,一是“零敲碎打”,大家都去“个体作业”,去研究自己“喜欢”的、认为是重要的基因,而另一种选择呢?则是前所未有的大胆说法:从整体上来搞清楚人类的整个基因组,集中力量认识人类的所有基因。,人类基因组计划的由来,人类基因组计划的孕育,经历了长达5年的时间,这五年里
3、,在发达国家里,上至政府首要,下至平民百姓,都参与了这一场讨论与最后的决策。而各国,首先是美国的科学家,作了大量的论证。 1984年, 在美国尤他大学召开的专业会议上,一些科学家已开始讨论对人类基因组DNA进行全序列分析的前景。 1985 年5 月,在美国加州组织了一次专门会议,美国能源部提出了测定人基因组全顺序的动议。 1986年,美国生物学家、诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco 在“Science”上发表短文首次提出人类基因组计划的设想,并建议组织国家级和国际级的项目来进行这方面的研究。 1986年3月,美国能源部在召开的一次专门会议上, 正式提出实施测定人类基因组全顺序的计划。
4、 1988年4月,国际人类基因组组织(HUGO)成立。,人类基因组计划的由来,1988年10月美国能源部和美国国立卫生研究院达成协议,共同管理和实施这一计划。 1990年,历经5年辩论之后,美国国会批准美国的“人类基因组计划”于10月1日正式启动。 随后法国、英国、意大利、德国、日本等也相继宣布开始各自的 研究。中国的人类基因组计划于1993年开始,1999年9月,中国正式参与国际人类基因组计划,负责测定人类基因组全部序列的1%。,HGP的目标,人类基因组计划的目标是通过以美国为主的全球性的国际合作,在大约15年的时间里完成人类24条染色体的基因组作图和DNA全长序列分析,进行基因的鉴定和功能
5、分析,最终目标是确定人类基因组所携带的全部遗传信息。 人类基因组计划的“科学产品”将是一个人类遗传信息数据库,将是一本指导人类进化的“说明书”。 有人将HGP比作一张20世纪的生命(生物学)周期表,因为它一改经典分子生物学零敲碎打地研究个别基因的习惯,而力求在细胞水平上解决基因组的问题,同时研究10万个基因及其产物,以建立对生命现象的整体认识。,HGP的主要内容,基因组作图 基因组测序 基因的鉴定和分析 基因组研究相关技术建立 有关模式生物研究 生物信息系统建立,基因组作图,人类染色体不能直接用来进行测序,故HGP的第一阶段是要将基因组这一巨大的研究对象进行分解,使之成为较易操作的小的结构区域
6、,这个过程简称为作图。 遗传图谱 物理图谱,遗传图谱,遗传图谱(genetic map),又称连锁图(linkage map),是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率,确定它们的相对距离,一般用厘摩(cM,即每次减数分裂的重组频率为1)来表示。 遗传图绘制需要应用多态性标志。如限制性酶切片段长度多态性(RFLP),短串联重复序列(STR, 又称微卫星,MS)标志,单核苷酸多态性(SNP)标志等。 通过遗传图谱,我们可以大致了解各个基因或DNA片断之间的相对距离与方向,如哪个基因更靠近着丝粒,那个更靠近端粒等。遗传图谱不仅是定位基因的重要手段,即使在人类基因组全物理图谱建立起来之后,它依然是研究
7、人类基因组遗传与变异的重要手段。,物理图谱,物理图包含了两层意义,一是获得分布于整个基因组的序列标签位点(STS,其定义为染色体定位明确,而且可用PCR扩增的单拷贝序列),使每隔一定距离就有一个标志;二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段DNA连续克隆系(Contig)。 酵母人工染色体(YAC,插入片段达数百kb至2Mb)、细菌人工染色体(BAC,插人片段为80一300kb)、P1噬菌体(插入片段最大为125kb)、PI来源的人工染色体(PAC,插人片段可达300kb) 物理图构建的成功,不仅为大规模测序奠定了基础,而且还绘制出了人类基因组转录图(或基因图)的雏形。,基因组测序,人类基因组
8、计划最终将测定出人类基因组的全部序列。这种序列测定不同于以往那种只对某一个特定的感兴趣的区域进行DNA序列分析的工作。它要求一种更高效的规模测序,并将测出的每一个DNA片段按其染色体位置进行准确的排列, 从而得到人类基因组DNA序列碱基排列的全貌。这是一个很艰巨的任务,需要开发更新的序列分析技术和计算机信息处理系统。这些新技术和新系统的开发与研制也将成为人类基因组计划的一个重要组成部分。 大规模测序的策略 基于BAC连续克隆系的测序 全基因组的“鸟枪法”测序,基于BAC连续克隆系的测序 通过精细物理作图,排出对应于特定染色体区域的重叠度最小的BAC连续克隆系后,就可以对其中的BAC逐个进行测序
9、。这是由各国政府及非赢利机构所支持的公共领域测序计划在20世纪90年代中期所确定的策略。其基本工作步骤是: 将待测BAC克隆随机切成小片段(约1.52kb); 将小片段克隆入测序载体; 对小片段DNA进行810倍左右覆盖率的测序; 将相互重叠的读出序列组装成连续的重叠线; 从质量最高的读出序列中取得序列; 利用引物延伸或其他方法对BAC克隆中还存在的缝隙进行填补。,全基因组的“鸟枪法”测序 这是一个十分大胆的构思,即在获得一定的遗传和物理图信息的基础上,绕过BAC克隆逐个排序的过程,直接将基因组DNA分解成2kb左右的小片段进行随机测序,辅之以一定数量的10kb克隆和BAC克隆的末端测序,利用
10、超级计算机进行序列组装。由Craig Venter领导的私营研究所TIGR于1995年首先将这一策略应用于微生物基因组的测序并获得成功。 序列的精度标准 工作框架图:45倍的覆盖率,错误率低于1%,90%以上的序列 完成图:1012倍的覆盖率,错误率低于1/10000,没有缺口 基因组中间的某些部分,主要是着丝粒区域和端粒区,因存在大量高度重复序列而非常不稳定,是目前还难以克隆的部分。因此基因组的最后完成序列并不包括这部分的序列。,测序方法图解 (1),Genomic DNA - 3 billion BP - 23 Pairs of chromo., 30 - 300 M bp ea,Cut
11、into big pieces - 150-200k bp (BAC) - 0.1-1.5 M bp (YAC),Clone pieces into bacteria or yeast: Each is a Bacterial Artificial Chromosome Need 20,000 BACs to represent human genome,Isolate DNA from Human tissue,Grow indiv. clones,测序方法图解 (2),Isolate plasmid DNA Containing human BAC,Cut into smaller pie
12、ces 2,000 bp,sub-clone each piece Into sequencing vector,Grow up And isolate DNA For sequencing,Sequence each sub-clone (500-800 bp/ sequencing run),ACTTAGTACGCAGAGGTC,测序方法图解 (3),Repeat the process for each sub-clone, and each BAC/YAC clone, but cut in different places to generate overlapping pieces
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