细胞凋亡及其调控分子机制.ppt
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1、细胞凋亡及其调控分子机制,凋亡的概念,与坏死的区别 凋亡信号通路 细胞凋亡相关蛋白、细胞凋亡与疾病 细胞凋亡检测,细胞凋亡名称的由来,英国Aberdeen大学病理系 Kerr教授,1972年我和Wyllie在研究中观察到一种不同于坏死的细胞死亡方式,联想到秋日落叶,我们 就把它称作 Apoptosis,Sydney Brenner 1/3 of the prize United Kingdom The Molecular Sciences Institute Berkeley, CA, USA b. 1927 (in Union of South Africa),H. Robert Horvi
2、t 1/3 of the prize USA Massachusetts Institute of Technology (MIT) Cambridge, MA, USA b. 1947,John E. Sulston United Kingdom The Wellcome Trust Sanger Institute Cambridge, United Kingdom b. 1942,THE 2002 NOBEL PRIZE WINNER,王晓东:,从事的是细胞凋亡规律的研究。2000年,他和助手们进行了一项实验,研究一种神秘的线粒体蛋白质Smac,这种蛋白质可以打破肿瘤的“坚硬堡垒”,诱使
3、肿瘤细胞“自杀”,对研究治疗癌症方法有重要帮助。从1996年他建立起自己的研究室后,他的论文成果在8年间被其他科学家引用超过了15000次。,第一节 细胞凋亡的特征及意义,一、细胞凋亡的基本特征,程序性细胞死亡programmed cell death, PCD在发育过程中定时出现的生理性刺激诱导的细胞死亡。用于选择性地清除多细胞动物体内一些无用的或危险的细胞。 依据形态学不同,程序性细胞死亡可划分为凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)、肿胀性死亡3种形式。 细胞凋亡:apoptosis 在生理和病理条件下,由基因控制的自主有序的死亡过程。 生理条件下,凋亡用以清除单个细胞,
4、继而由巨噬细胞内吞,最后再由溶酶体执行降解功能。 自噬autophagy:是一种在进化上保守的真核细胞内转运泡的运输机制,它可将细胞本身的亚细胞成分如蛋白、胞质或细胞器,通过溶酶体中的水解酶进行消化降解和循环。 凋亡和自噬都是细胞内重要的生理过程。 坏死Necrosis :各种致病因子,干扰和中和了细胞的正常代谢活动,造成细胞的意外死亡。,诱发因素 特定的生理病理因素,药物 缺氧、药物、毒素 组织分布 单个细胞分布 成片细胞 组织反应 形成凋亡小体,被周围组织 细胞内容物溶解 细胞吞噬,无炎症反应 释放,有炎症反应,坏死,凋亡,形态学:,细胞体积 皱缩变圆,细胞浆失水浓缩 肿胀,外形不 规则化
5、 细胞膜 保持完整,形成泡状,凋亡 破裂 后期内陷包裹核物质和细胞器 形成凋亡小体 细胞核 核膜完整,核皱缩,染色质固缩 核肿胀破裂, 聚集在核膜下,最后核裂成碎片 染色质不规 则外移 细胞器 大多数保持完整,线粒体肿胀, 多受损,溶 通透性增加,释放细胞色素 酶体破裂,线 粒体肿胀破裂,凋亡,坏死,DNA 阶梯状片段化 随机断裂 磷脂 凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻 外翻 ATP 合成并提供能量 耗竭,凋亡,坏死,生物化学:,出现180-200bp大小及其倍数的核苷酸片段,DNA LADDER,细胞坏死与凋亡的形态区别,细胞凋亡的诱发因素,细胞凋亡的生理意义,1、 确保正常发育、生长,根据代谢需要
6、调节细胞数量、保持成体器官正常体积。 如:指(趾)间隙的形成 2、 维持内环境稳定 如:清除受损、突变或衰老的细胞 3、 防御功能 如:使受到病毒感染的细胞凋亡,第二节 细胞凋亡的发生机制,一、 凋亡相关基因 (一)ced 基因 线虫(c. elegans),1090个体细胞,其中131个细胞在发育过程中产生凋亡,发现14个基因与凋亡有关;且虫体透明,易于观察。,细胞内与凋亡有关的基因分2类:,1存活基因:ced-9: bcl-2蛋白家族 2致死基因:ced-4: 凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1, apoptosis protease activating factor-1, 3. 致死基因:
7、ced-3: Caspase 家族 (cycteinyl aspartate-specific protease).天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶,线虫,人类,Caspase:,1996 年 Alnemri 等统一命名的一类与ICE/Ced-3 同源性半胱氨酸蛋白酶。,(二)caspase 与细胞凋亡,1.特点: (1) 是一种Cys 蛋白酶 (2) 底物Asp-X (3) 以酶原形式存在 (4) 活化的Caspase 特异性水解一套底物,导致不可逆的细胞凋亡 (5) 细胞内有Caspase抑制剂。 IAP, inhibitors of apoptosis proteins,2. 结构特征,以无
8、活性的形式存在。 在Pro-Caspases的N端均含有一段的前区域(Prodomain)。 活性形式均是由2个大亚基和2个小亚基组成的杂四聚体。 一分子Pro-Caspase只能分裂产生1个大亚基和1个小亚基 。 大亚基的C端含有活性中心,其中半胱氨酸(C)是必需氨基酸,故属于半胱氨酸蛋白酶类。,3. 分类:14种 (1)细胞因子前体: caspase 1,4,5, 11,12,13,14 不是凋亡的直接效应分子。 (2)凋亡起始分子: caspase 2,8,9,10 (3)凋亡效应分子: caspase 3,6,7 参与介导细胞凋亡。,ICE家族成员 A:3类caspase:蓝色参与炎症
9、反应,红色为执行者,绿色为启动者;B:caspase-3的结构模型;C:caspase-3的活化过程,执行者,启动者,4. caspase活化: Caspase 酶原有很低的活性 若caspase 过表达,酶原在高浓度下可自身活化 Caspase 8,9 含有死亡效应域(death effect domain , DED),可相互作用,使酶原自身活化。 Caspase 8:激活所有酶原,如:Caspase 3,6,7,9 Caspase 9:活化需线粒体释放Cyt C, 活化后激 活Caspase2, 3,6,8,10。 Caspase 3,6,7: 效应 Caspase 。,5. Caspa
10、se 作用:,(1)灭活细胞凋亡抑制蛋白: 鼠: Caspase活化的DNA酶: Caspase activated deoxyribonuclease, CAD, 细胞凋亡抑制物:inhibitor of CAD, ICAD ICAD与CAD结合,CAD无活性, Caspase剪切ICAD,ICAD失活,CAD活化, CAD游离,进入细胞核内降解DNA。 人:Hela cell,DFF(DNA fragment factor) ,与ICAD同源,Ca2+/Mg2+ 依赖的核酸内切酶: 多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)抑制Ca2+/Mg
11、2+依赖的核酸内切酶,与基因完整性的监护有关。 PARP降解, Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶活性增加,裂解核小体间的DNA,导致细胞凋亡。,Caspase,(2) 降解细胞结构蛋白: 降解核纤层蛋白,肌动蛋白,核分裂相关蛋白,(3)切割细胞效应蛋白。,(4)降解其他的caspases,6 . Caspase活化抑制剂 IAP, inhibitors of apoptosis proteins 细胞内存在的Caspase抑制蛋白,IAP inhibitors of apoptosis proteins家族,阻止细胞凋亡过程。,二、细胞凋亡的诱导发生 细胞凋亡的信号传递 (1)Fas介导细胞
12、凋亡 (2)细胞色素C介导的细胞凋亡 (3)粒酶GrB诱导细胞凋亡,1,2,DR:死亡受体 death receptors, DR 含DD:死亡结构域,death domain, DD (DD存在于DR之胞内区,和FADD蛋白中) FADD蛋白:Fas相关的死亡结构域,Fas-associated death domain (FADD蛋白含有DD,DED;可与pro-caspase 8结合) DED:死亡效应结构域,death effecter domain, DED (存在于FADD蛋白、一些起始caspase酶原如pro-caspase 8中),(1)死亡受体介导的细胞凋亡(外源性的),F
13、as-细胞表面受体,跨膜蛋白;,共4个蛋白,1. Fas Ligand(FasL) 是Fas 的天然配体,两者介导细胞凋亡,Fas L主要在淋巴细胞膜上表达。,2. Fas Fas /Apo-1存在于细胞表面的特定区域,一旦被Fas L或Fas抗体激活,可将信号传递到细胞内。 Fas 属肿瘤坏死因子受体(TNFR)及神经生长因子受体(NGFR)超家族,是细胞凋亡的受体信号,又叫死亡分子。,Fas/Apo-1 (CD95),Fas 从人KT3细胞株分离的cDNA克隆。 Apo-1从人SKW6.4细胞株分离的cDNA克隆。 后来证明两者完全一致,命名为Fas/Apo-1,或称CD95。 Fas蛋白
14、位于10q33,编码335AA,成熟319AA,是跨膜蛋白。 由胞外区,跨膜区、胞内区组成。 胞内区有80AA,称死亡结构域(death domain, DD),3. FADD蛋白: Fas相关死亡结构域蛋白:Fas-associated death domain protein 包括:DD ,死亡结构域 death domain DED ,死亡效应结构域 death effect domain,Death inducing signal comples, DISC,Fas L与Fas 结合(同三聚体) Fas 的DD成簇,与FADD蛋白结合, FADD 蛋白活化 Caspase 8活化 Ca
15、spase 3,6,7活化 细胞凋亡,(1)Fas介导细胞凋亡,死亡诱导信号复合物 Death inducing signal complex, DISC,诱导因素跨膜电位( m) PTP开放(通透性转换孔) 凋亡启动因子(细胞色素C,smac,AIF)释出 AIF:凋亡诱导因子,(2)线粒体相关的细胞凋亡途径(内源性的),现在,提得最多的、比较公认的线粒体在凋亡中的作用有两点: (1)细胞色素C的释放; (2)Smac/Diablo 的释放。,(2)细胞色素C介导的细胞凋亡,Cyt C 释放入胞质 与胞浆接头蛋白Apaf-1结合 Apaf-1寡聚化,募集Caspase 9原 Caspase
16、9 活化 Caspase 2,3,6,8,10 活化 细胞凋亡,凋亡蛋白酶激活因子1,Apoptotic protease activating factor-1,Caspase recuitment domain,5 Fas介导细胞凋亡,Caspase 8活化,凋亡诱导因子,凋亡蛋白酶 激活因子,EndoG:endonuclease G 核酸内切酶G AIF:Apoptosis inducing factors Apaf-1:Apoptotic protease activating factor-1,线粒体仍有足够的Cyt C,及其他细胞色素,呼吸链完整,产生ATP,保证 Caspase
17、活化,细胞凋亡。 Cyt C释放过多,呼吸链破坏,氧消耗,但是不产生ATP,导致细胞坏死。 细胞含有caspase抑制剂,不能导致caspase依赖的细胞凋亡;,当线粒体巨通道破坏,Cyt C释放:,AKt JNK p53,Bcl-2,(3)粒酶的基本结构和功能 定义:粒酶,Granzyme,Gr,是CTL和NK细胞杀伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称,以酶原形式存在。 分类:GrA, GrB, GrH, GrM, 类胰蛋白酶2 功能:酶切靶细胞的多种底物蛋白,启动细胞凋亡。 GrB活性最高,与其他粒酶,穿孔素(PEN, Perforin)一起储存在CTL的杀伤颗粒中。,粒酶进入靶细胞:,CTL
18、识别靶细胞,杀伤性颗粒移向靶细胞一极(极化) GrB, PEN 等蛋白释放入细胞间隙 穿孔素(PEN) 协助GrB 进入靶细胞,定位在胞浆和胞核,CTL,肿瘤细胞,CTL正在诱导肿瘤细胞凋亡,GrB诱导细胞凋亡,(1) Caspase依赖途径: GrB 切割 Caspase 10 Caspase 3, 7, PARP(多聚ADP核糖聚合酶),Bid,DNA片段化因子(DFF) 细胞凋亡 GrB确保靶细胞即使缺失1种或几种Caspase成员时,仍能走向凋亡。,切割 DFF,使CAD游离,降解DNA 结构蛋白Filamin,使细胞骨架破坏 PARP,使Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶活性增加,裂
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- 细胞 及其 调控 分子 机制
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