细胞化学染色2009-2-25.ppt
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1、第二节 细胞化学染色 (cytochemical stain),临床检验与输血学系 胡嘉波,概述,细胞化学 (组织化学,组化)染色以形态学为基础并结合化学或生物化学技术,对细胞内各种化学成分、代谢产物作定位、定性和半定量检查的一门科学。可弥补单纯细胞形态学检查识别的不足。,细胞化学染色临床意义: 1.辅助判断急性白血病的类型。仅从细胞形态学观察白血病的诊断正确率约5070%,如结合细胞化学染色则可提到90%以上。 2.辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断。,不同细胞化学染色,染色步骤不同,但基本步骤为固定、有色沉淀反应及复染。,1.固定 为了保持细胞结构及化学成分的不变,需对细胞进行固定。根据染
2、色的成分不同,选择合适的固定液,使细胞内的蛋白质、酶类、糖类等变成不溶性物质。固定的方法有物理法和化学法,临床上常用的是化学法固定。物理法包括干燥和火焰固定;化学法包括蒸汽固定和液体固定,如甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等。,2. 有色沉淀反应,通过不同化学反应,使被检测的化学物质最终形成稳定的有色沉淀。列举以下三种化学反应: (1)偶氮偶联法:含萘酚的底物,在相应酶的作用下释放出萘酚,萘酚与重氮盐(如坚牢蓝紫酱GBC、坚牢蓝B、六偶氮付品红等)结合,偶氮偶联形成有色沉淀。如NAP染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、ACP染色等。,(2)普鲁士蓝反应:铁与酸性亚铁氰化钾作用,形成如亚铁氰化铁蓝色沉
3、淀,如铁染色。 (3)雪夫反应: 过碘酸氧化细胞内糖类中的乙二醇基形成乙二醛基,醛基与雪夫试剂作用,使无色品红形成红色沉淀物,如过碘酸-雪夫反应。,3.复染,目的在于使各种细胞能显示出来便于观察。选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度,即能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化学染色结果。如铁染色复染常用中性红,过碘酸-雪夫反应常用甲基绿。对核着色效果较好的有中性红、甲基绿、苏木精、核固红、沙黄等,使浆着色较好的有伊红、刚果红、光绿等。,一、过氧化物酶染色(POX),【原理】 粒细胞和单核细胞的胞浆中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO),能将底物H2O2分解,产生
4、新生态氧,它能够将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化,则显棕色四甲基苯醌二胺。若加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合,可形成稳定的蓝色颗粒,定位于细胞浆酶所在部位。,骨髓片POX染色,骨髓片POX染色,APL:呈强阳性反应,AML-M4:部分呈阳性反应, 部分成弱阳性反应,AML-M5:呈弱阳性,ALL:呈阴性,3%,正常血细胞的染色反应,过氧化物酶主要存在于粒细胞和单核细胞中。原粒大多呈阴性反应,部分可出现少量阳性颗粒。自早幼粒细胞起至成熟中性粒细胞均呈阳性反应,并随着细胞的发育成熟阳性反应程度逐渐递增,中性分叶核粒细胞呈强阳性反应。 淋巴细胞、幼红细胞、巨核等均呈阴性反应。,PO
5、X染色临床意义,主要有助于急性白血病类型的鉴别 (1)急粒其白血病性原粒细胞可呈弱阳性反应,颗粒粗大,呈局灶性分布;急淋其原淋细胞和幼淋均呈阴性反应;急单时白血病性原单呈阴性反应或弱阳性反应,颗粒细小,呈弥散分布。 (2)急单与恶性组织细胞白血病鉴别:异常组织细胞 POX染色呈阴性反应,急单白血病细胞呈弱阳性反应。,二、苏丹黑B染色,【原理】 苏丹黑B(Sudan black B,SBB)是一种脂溶性重氮染料,能溶解细胞内的含脂结构(如中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇)中,而使脂类物质显示出来,呈棕黑色或深黑色。脂类物质在粒细胞中丰富,单核细胞中也有少量。,【正常血细胞的染色反应】 结果与POX染
6、色基本一致。 【临床意义】 本染色临床意义与POX染色基本相似。 【方法评价】过氧化物酶染色要求涂片新鲜,保持酶活性,才能得出正确结果,而苏丹黑B染色则无此要求。虽然SB染色临床意义基本同POX染色 ,但其灵敏度及特异性两者有所不同。SB染色的特异性低于POX染色,POX阳性见于髓系细胞,而SB阳性也可见于淋系细胞;但SB染色的敏感性高于POX染色,例如急性粒细胞白血病POX染色阴性的患者,其SB染色可阳性。,三、中性粒细胞NAP染色,【原理】 中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶能水解磷酸萘酚钠,释放出萘酚,后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于酶活性处。,中性粒细胞碱性磷酸酶染色(NAP),+
7、,+,+,+,+,+,-,嗜酸粒细胞-,NAP积分 油镜下计数100个中性杆状核、分叶核粒细胞,分别记录其分级情况,全部阳性细胞之和即为阳性率。将得出各种积分的百分率乘以该积分数,再相加即为积分值。 例:4分 占20 4 x 20=80分 3分 占40 3 x 40=120分 2分 占18 2 x 18=36分 1分 占10 1 x 10=10分 0分 占12 0 x 12=0分 阳性率88 积分=246分,NAP临床意义,1.细菌与病毒性感染的鉴别:前者增高,后者降低。 2.类白与慢粒的鉴别:前者增高,后者降低。 3.急性白血病类型鉴别:急粒NAP积分值减低,急淋NAP积分值增高。 4.PN
8、H与再障鉴别:前者减低,后者增高。 5.真红增多症与继发性红细胞增多症鉴别:前者增高,后者无明显变化。 6.白血病前期与增生性再障的鉴别:前者NAP积分减低,后者增高。,四、酸性磷酸酶染色,【原理】 酸性磷酸酶(ACP)存在于细胞的溶酶体颗粒中,有些细胞中的酸性磷酸酶耐酒石酸,故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及鉴别诊断。染色方法有偶氮偶联法和Gomori硫化铅法,以前者为常用。,偶氮偶联法 血细胞内的酸性磷酸酶在酸性(pH5.0)条件下水解基质液中的磷酸萘酚AS-BI,释放出萘酚AS-BI,后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀,定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮
9、盐为六偶氮付品红,形成红色的沉淀。,抗酒石酸酸性磷酸酶染色 用相同方法制备两份基质液,一份再加入适量的L-酒石酸(tartaric acid),另一份不加酒石酸。取两张相同标本的涂片,分别用这两种不同的基质液做酸性磷酸酶染色。如果血细胞内的酸性磷酸酶耐L-酒石酸,两张均呈阳性;如不耐L-酒石酸,不加L-酒石酸呈阳性反应,而加L-酒石酸呈阴性反应。,阳性反应为鲜红色或深红色颗粒,定位于胞浆。 所有血细胞的酸性磷酸酶染色均为阳性,但是单核细胞、组织细胞、巨核细胞和毛细胞反应较强。 抗酒石酸酸性磷酸酶染色:毛细胞白血病的毛细胞出现强阳性反应。除少数淋巴细胞表现弱阳性反应外,粒细胞、单核细胞和巨核细胞
10、皆为阴性。,临床意义:,帮助诊断多毛细胞白血病:毛细胞呈阳性(常呈强阳性),阳性反应不被L-酒石酸抑制。慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞ACP染色也可呈阳性,但可被L-酒石酸抑制。但ACP阴性者,并不能排除多毛细胞白血病的可能性。 帮助鉴别T细胞与B细胞:TL(+),BL(-) 帮助鉴别Gaucher病与Niemanm-Pick病。 单核、组织、网状、巨核细胞ACP染色均呈阳性反应。,五、过碘酸雪夫反应,【原理】 细胞内含有乙二醇基的糖基在高碘酸的氧化作用下产生双醛基,后者与雪夫(Schiff)染料作用,使无色品红变为紫红色染料沉积,定位于含有多糖成分的部位。根据胞质中糖原含量多少
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- 细胞 化学 染色 2009 25
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