生物制药课件(第六章).ppt
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1、第六章 核酸类药物,本章主要内容 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 主要核酸类药物的生产工艺 本章要求 (1)掌握酶解法制备核苷酸的方法 (2)掌握发酵法生产肌苷酸的基本方法; (3)了解叠氮胸苷、阿糖腺苷等的生产方法; (4)了解核酸类药物的分类以及主要临床用途,第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产,一、核酸(DNA与RNA)的提取与制备 (了解) 1、工业用RNA的提取 (1)RNA及其工业来源,(2)高RNA含量酵母菌株的筛选 1.从自然界筛选 2.诱变育种 (3)用工业废水培养高含量RNA酵母 菌体在味精废水中( 还原糖0.7 总糖 1.2 总氮0.2 总磷0.5 无机盐 0.1-
2、0.2 )驯化培养,发酵24小时,RNA含量8-10,酵母菌主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中,例如,在水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。,物理诱变:射线、离子束、微波、超声波 化学 诱变:硫酸二乙酯(DFS)亚硝基胍(NTG)等 生物诱变:病原微生物诱变,转基因诱变,(4)RNA提取实例,碱解,230ml1.3%NaOH,碱解液,100g压榨啤酒酵母,6mol/L HCL, pH7,15min,20 ,30min,清液,沉淀,10 , Ph2.5 6mol/L HCL,离心,置冷过夜,1.8g RNA (纯度80),中和,离心,(二)DNA的提取与制备 1工业用DNA的提
3、取,粉碎,新鲜冷冻鱼精,水,100 15min,浆状鱼精,加热去杂蛋白,离心,含热变性DNA溶液,乙醇,丙酮,纤维状DNA,沉淀,离心,95乙醇,洗涤,减压干燥,DNA粗品 (含50-60热变性DNA),2、生物活性DNA的制备,肝、脾、胸腺,4倍生理盐水,捣碎,匀浆,匀浆液,离心,2500r/pm,30min,沉淀1,洗涤3次,悬浮,生理盐水,悬浮液,捣碎,离心,3min, 5SDS,搅拌2-3h, 0,2500r/pm,上清液,冷95乙醇,离心,纤维状DNA,洗涤,冷乙醇、丙酮,减压、低温干燥,DNA粗品,粗品DNA,蒸馏水,5SDS,搅拌1h,离心,5000r/pm,清液,NaCL,95
4、冷乙醇,沉淀,DNA沉淀,洗涤、真空干燥,乙醇、丙酮,活性DNA,二、核苷酸的制备方法(熟悉) 水解法(DNA或RNA经酶或碱水解) 发酵法 半合成法,(一)酶解法及碱水解法制备核苷酸,1.酶解法制备脱氧核苷酸,桔青霉产生核酸酶P1,核酸酶P1 酶法生产5核苷酸的主要工业用酶 来源:桔青霉(Penicillium citrinum)发酵 催化特性: 1)水解单链RNA和DNA中的3-5磷酸二酯键 (磷酸二酯酶活力强) 2)水解单核苷酸和寡核苷酸中的3-磷酸单酯键,2、酶解法制备5单核苷酸,CMP,CMP,CMP,CMP,3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸(IG) I+G:呈味核苷酸,4菌体自溶法生产
5、核苷酸 原理:磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5-核苷酸。 (1)谷氨酸产生菌体自溶法生产5-核苷酸工艺流程:,5碱水解法生产2,3-混合核苷酸,RNA水溶液,33.5%,碱解,0.3mol/lNaoH,保温,38,16-20h,水解液,中和,6molL盐酸,2,3-核苷酸,2,3环状磷酸酯,分解,RNA,注意:酶法降解RNA得到的是5核苷酸 碱水解法降解RNA生产2,3混合核苷酸,(二)发酵法生产核苷酸 1发酵法生产肌苷酸(IMP) 菌种:产氨短杆菌 对菌种的要求: 1)使用腺嘌呤缺陷型菌株(解除腺嘌呤衍生物的反馈抑制) 2)菌体自身的5核苷酸降解酶活力低 3)选用Mn2+不
6、敏感性变异株(培养基中添加限量Mn2+,以增加细胞膜的通透性,使肌苷酸在胞外大量合成),(三)半合成法制备核苷酸 工业生产的呈味核苷酸约有40-50是由半合成法而制得 半合成法制备核苷酸的基本路线: 发酵法生产核苷提取、精制 磷酸化 5-核苷酸,肌苷,氯化氧磷,磷酸三乙酯,水,磷酸化反应,2h,5-IMP(产率91),发酵,三、核苷的制备 化学法 发酵法 ()RNA化学水解法制备核苷 1核苷生产工艺流程(图148),图14.8 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷生产工艺流程图,1.水解,2.离子交换分离,3.浓缩,4.结晶,(鸟苷腺苷尿苷胞苷)磷酸,(腺苷尿苷胞苷),(阳离子交换),阴离子交换,阴
7、离子交换,(二)发酵法生产核苷 规模: 千吨/年 优点:产量大,周期短,易控制。 产核苷菌株的共同特点: 选用磷酸单酯酶活力强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆菌的诱变出发菌株; 用物理或化学法筛选出诱变菌 发酵培养时必须提供限量的生长因素,并且好氧,在某一特定的范围内累积大量核苷。,1发酵法生产肌苷 菌种:枯草杆菌,保藏斜面菌种,32 活化,20h,生产斜面种,32 ,15h,一级种子液,1 %接种量32 ,8h,二级种子液,1 0%接种量,1.2L 发酵罐,发酵液,过滤,除菌体,发酵清液,阳离子交换树脂,洗脱液,活性炭吸附,洗脱液,减压浓缩、冷冻结晶,肌苷粗品,其它产肌苷菌种:产氨短杆菌,第二节
8、核酸类药物,核酸类药物的分类: 第一类:天然核酸类物质 (与代谢障碍疾病有关) 第二类:自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或聚合物 (抗病毒、肿瘤、艾滋病药物,产生干扰素、免疫抑制),一、叠氮胸苷(Azidothymidine,AZT) (一)结构与性质 AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病药 (二)生产工艺 以胸苷为起始原料进行化学合成,工艺特点:原料来源少,合成路线复杂,成本高。,叠氮胸苷的合成工艺路线,起始原料胸苷的制备方法: DNA水解法 (主要方法),2-脱氧胞苷,2-脱氧鸟苷,2-脱氧腺苷,+,胸腺嘧啶,大肠杆菌磷酸化酶,胸苷,鸟苷,胸腺嘧啶,嘌呤核苷磷酸化酶,嘧啶核苷磷
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- 生物制药 课件 第六
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