细胞生物学 第三章.ppt
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1、第三章 细胞生物学研究方法 一、细胞形态结构观察 一光学显微镜 普通光镜的性能指标:放大率(放大倍 数),分辨力,清晰度、焦点深度,镜象亮 度 分辨力(分辨率、分辨本领):能分辨两 个物点之间最短距离的能力,通常是以分辨 距离来表示的,即分辨距离越小,则分辨力 越高。 人肉眼分辨力测试,是规定在明视距离为 25cm所分辨的最短间距来表示,正常人肉眼 分辨力的极限值是0.1 mm毫米。显微镜的分 辨力可按下列公式来计算 : R=0.61 / NA (R是分辨距离,0.61是常数,是照明光波波长 ,NA是显微镜物镜的镜口率光学性能指 标,每个物镜的外壳上都标有其镜口率的数值 )。 分辨距离R与镜口
2、率NA成反比关系 若把最大镜口率1.25( 即油镜镜口 率)代入公式,可见, 最小分辨距离 。 由于可见光中最短波长(紫光)0.4m (即400nm), 普通光镜最大分辨 力的理论极限应为0.2m。 请记 住 0.2 ! 这个数值就是显微 水平与亚(超)微水平的分界线。 显微镜的分辨力有一定的极限, 其放大率受分辨力制约而不可能无限 提高。 普通光镜放大率的经验界值 :有效放大倍数极限 物镜最大镜口 率1000 例: 普通显微镜的油镜镜口率为 1.25,故此台显微镜的最大有效放大倍 数为1250倍。 高级研究显微镜的油镜镜口率为1.4 ,则此镜的最大有效放大倍数为1400 倍。 如果放大倍数超
3、过限度, 则视野中物 象会变模糊 ,细微结构反倒分辨不清 ,成为了 无效放大。 由于物镜镜口率 受入射镜口角和介质折射率的限制, 不可能再更进一步提高了。 所以科学 家们从另外两个途径来改进显微镜: i.换用短波长的“照明光源”,来提高 分辨力。如: 紫外光显微镜、电子显 微镜 ii.应用特殊光学效应, 增强反差, 来 提高分辨能力。 如:相差显微镜、微 分干涉显微镜 相差显微镜 phase contrast microscope 原理:光波的三个光学特性:(1)光波有 波长。 对于光波波长变化,肉眼觉察为颜色变 化;(2)光波有振幅。 对于光波振幅变化(即 振幅差),肉眼觉察为明暗变化; (
4、3)光波 有相位( 相位是指某一时刻, 光在其前进路 线上的位置)。对于光相位的变化(即相位差 ),肉眼是不能觉察的。 当光线穿过无色透明且非匀质的被检物体( 如活细胞),其波长和振幅都无明显变化,仅 光相位出现了一定程度的变化,此时观察会感 觉反差较小,对物体内部的结构难分辨,这就 是普通光镜不适宜用于观察活细胞的原因。 相差显微镜却是运用一些特殊装置,使通 过被检物体的光线分离成两组光波,并人 为地促使这两组光波之间微弱的相位差加 大,再经过光波干涉作用,使看不见的相 位差转变成可见的振幅差,从而造成反差 增强,便能够清晰看到被检物体及其内部 细微结构了。所以,相差显微镜下的样品 标本不需
5、染色,即可以十分清晰地观察活 细胞及其内部结构的变化。 特点: 相差显微镜的观察效果是被检物 体比其周围背景略暗,而物体外围显现有 一圈明亮的光环。 倒置显微镜则是将相差显微镜的构 件颠倒装配,本末倒置而成的,并 装有恒温设备、闭路电视和缩时摄 象机,是能够完善适用于细胞培养 的观察监视系统。 微分干涉显微镜却是另一种不需染 色而可以直接观察活细胞精细结构 及动态变化的技术设备,其分辨率 比普通光镜要提高一个数量级。 3.荧光显微镜 fluorescence microscope 原理:以紫外光为光源,使被检材料 中的荧光物质激发出荧光,从而对细 胞内某些物质进行定性和定位分析。 荧光现象有两
6、种:1.自发荧光细胞内 某些天然荧光物质被紫外光照射所 激 发 的 荧光, 例,叶绿素血红色 自发荧光;2.诱发荧光在细胞中加入 某种不会使细胞化学组分变性的荧光 染料( 荧光素 ), 与细胞内某种特 定成分结合在一起,经紫外光照射激 发出荧光。 例:荧光染料吖啶橙,可使RNA发 出红色荧光,而使DNA发出绿色荧 光。 结构特点:1 采用紫外光发生装置 : 高压汞灯 + 激发装置 + 滤光装 置 2 透镜由石英玻璃制成 ,以便减少光通路上的紫外光损耗 3 目镜中要装压紫滤片 荧光显微镜目前在分子细胞生物学研究中应 用十分广泛,以荧光素标记各种探针进行基 因定位分析或对某些特定蛋白质进行定性定
7、位检测分析,灵敏清晰。在荧光显微镜下对 样品可同时采用两种以上荧光探针检测,依 据其不同颜色的荧光信号,我们能一次判断 识别多个基因(或蛋白)的位点,因此这是 非常实用的研究技术。例如,绿色荧光蛋白 GFP 可用于进行活体观察。 此外, 由于 在荧光标记检测实验中, 易发生一些非检 测目标出现假象的 “背景噪音” 问题, 因 而现可在荧光显微镜设备上安装一套“数字 成像处理系统”,即把图像信息通过摄像机 和电脑的图象数字化处理,使信号反差得以 放大增强,对假象削弱或消除,从而明显提 高检测的准确率和灵敏度。 激光扫描共焦显微镜 Laser scanning confocal microscop
8、e 激光扫描共焦显微镜的物镜和聚光镜是 聚焦于同一焦点之上,故能排除焦平面 以外荧光的干扰,因此其分辨率比普通 荧光显微镜要提高1.41.7倍, 并还能 以“光学切片”方式去观察较厚样品之 中的内部精细结构。 (二)电子显微镜 1.透射电镜 transmission electron microscope , TEM 透射电镜的成像光路图,与光镜的基本类似 。只不过是以电子枪所发射的高速电子流代 替了照明光源,又以三组电磁线圈所构成的 磁透镜代替了玻璃制成的聚光镜、物镜和目 镜。 第一组磁透镜能将电子流聚集到样品 上 ( 故称为会聚镜),第二组磁透镜能使 穿透过样品的电子射线折射形成初级放大象
9、 (称为物镜),而第三组磁透镜则是通过第 一、第二中间镜和投影镜进行连续三次的再 放大,最终投射到荧光屏上,使电子图象转 变成可见的光学图象。 特点: (1)照明光源不同; (2)放大倍数的调节方式不同。 是依靠改 变磁透镜的激磁电流强度来调节放大倍数的 。也就是说,电流强度的变化引起了磁场强 度的改变,而磁场强度的变化又使电子射线 的折射程度发生改变,因而放大倍数即随之 出现变化。 (3)具有高压稳压系统。 电子流的发射速 度及波长皆取决于电压的高低,通常透射电 镜的电压达几万十几万伏的高压。 (4 )有高度真空的工作系统。因为高速运 动的电子流如果与空气中的微粒和分子碰撞 就会改变它的发射
10、方向,导致成像模糊。故 要求电镜内的工作系统(包括样品室)都必 须保持高度真空状态, 并且样品都必须脱 水。因此说,透射电镜不能用来观察活的样 品。 (5)样品厚度必须 3nm - - nm-m nm-m 成象机制 简单 简单 复杂 复杂 一般 简单 Nuclear magnetic resonance 核磁共振 Atomic Force Microscope 原子力显微镜 二、细胞生化分析 (一)组织化学和细胞化学染色法 histochemical and cytochemical staining methods 利用某种显色剂能与某种细胞成分特异 性相结合,显示特定颜色的原理,对组 织和
11、细胞内某些成分进行定位和定性分 析的研究方法。可对无机盐、蛋白质、 醛类、碳水化合物、脂类、核酸和酶类 等多种成分检测鉴定。 例:孚尔根反应(Feulgen) 特定显 示DNA的细胞化学技术。 其原理是, 经稀 盐酸水解打开DNA上嘌呤碱与脱氧核糖之间 的连接键,暴露出醛基,由于自由醛基能与 无色品红(希夫试剂)反应形成紫红色的化 合物,据此可对细胞内的DNA进行定性和定 位检测。 此外,由于其染色的深度与DNA 浓度是成正比关系,所以当孚尔根法染色后 ,再用显微分光度计测量,即可对细胞内的 DNA含量进行定量测定。 再例:Comori法显示酸性磷酸酶: 磷酸脂 磷酸根 磷酸铅 硫化铅(棕黑色
12、 ) 酶解 pH5.0 铅盐硫化铵 (二)免疫细胞化学immunocytochemistry 依据抗体能与对应的抗原自行相互识别 结合的免疫学原理,来检测特定蛋白质 在细胞内的分布状况。首先将某种抗体 联结上标记物(光镜观察用的标记物是 荧光素或酶;而电镜观察用的标记物是 胶体金),再与组织或细胞样品混合反 应,随后在光镜或者电镜下检查标记物 沉积的部位,即对抗原进行定位测定。 如果标记物是荧光素,则是在荧光显微 镜下检查荧光信号部位,以显示抗原所 存在的位置。 抗体与抗原结合的方式分直接法和间接法两种 ,直接法是先制备抗血清, 将抗体与荧光素结 合,然后再用其浸染样品,待荧光抗体与抗原 结合
13、反应后,再在荧光显微镜下鉴别抗原的存 在部位。而间接法的不同之处是在抗原抗体 初级反应的基础上,再增加一种能同初级抗体 发生结合反应的次级抗体(即“抗抗体”), 从而使初级反应效果得到“放大”,以增强分 析观察的灵敏性和准确性。如果与抗体联结的 标记物是酶,则可采用与酶的底物反应, 产生 呈某种颜色的沉积物,再依据这种特定颜色沉 积物的出现位置,来对探测物质的定性定位分 析,这被称为酶标抗体法。 例如, 辣根 过氧化物酶 是常被用作标记物的酶, 该酶 可催化过氧化氢与二氨基联苯胺 发生氧化反应 ,形成棕色的沉积物,从而便于在光镜或电镜 下进行观察分析。 (三)显微分光光度测定技术 micros
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