生化实验技术与方法.ppt
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1、糖的薄层层析,实验原理 薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层,将要分析的样品滴加到薄层上,然后用合适的溶剂进行展开,使样品各个成分分离,然后进行定性鉴定和定量测定。 根据原理的不同薄层层析通常有4种类型:吸附薄层层析,分配薄层层析,离子交换薄层层析和薄层电泳。,实验操作 硅胶薄板的制备:注意胶要均匀。 1.2 g硅胶H加4.0 ml0.5%CMC溶液,研磨数分钟后,倒在预先准备好的玻璃板上,铺开,使浆液分部均匀,放在水平台上,自然晾干。,2. 板的处理: 薄板的活化:105,0.5h 薄板的刮分:径向层析的优点是:样品展层后图谱呈弧形带状,使Rf值
2、相近的化合物也能清楚地分开。 3. 点样:样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量8-10l。注意:点样点的直径小于5mm,点样要少量多次,吹风机风力不能过大。 4. 展层:展层溶剂为:乙酸乙酯:甲醇:乙酸:水=12:3:3:2(体积比),新鲜配制。 5. 显色:显色剂:苯胺-二苯胺-磷酸试剂。,20mm,10mm,30mm,8mm,苯丙氨酸解氨酶的提取纯化,实验原理 苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine:ammonia lyase,简称PAL;EC4.3.1.5)是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶,与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关,在植物正常生长发育和抵
3、御病菌侵害过程中起重要作用。 本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。,仪器 高速冷冻离心机;恒温水浴;电子天平;柱层析系统 试剂 酶提取液:0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液(含1mmol/LEDTA、20mmol/L-巯基乙醇) 固体硫酸铵 0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0,含0.5mmol/LEDTA,2.5%甘油,20mmol/L-巯基乙醇); DEAE纤维素52,操作步骤 酶液提取 (1)植物材料2g,剪成小段,加入5倍体积的酶提取液,于冰浴上用研钵研磨。 (2)将已匀浆的酶液转入离心管,4000r冷冻离心30min。 (3)取离心后
4、的上清液(酶粗提液),量出其体积,留样 0.5ml 。 硫酸铵分级沉淀酶蛋白 (1)根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表,算出达到38%饱和度应加入酶粗提液中的硫酸铵量,并称硫酸铵。(240g/L) (2)将酶液倒入烧杯内,边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵,待全部加完后,再缓慢搅拌10min;然后于9000r离心15min,保留上清液于烧杯内。 (3)根据硫酸铵饱和度用量表,算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵用量。 (222g/L) (4)按上述(2)步同法处理,离心后,弃去上清液,保留沉淀。 (5)将沉淀溶于2ml酶抽提液中,留样 0.5ml 。 透析脱盐 酶液装入透析袋,放入低盐溶
5、液中透析过夜,留样 0.5ml 。,银杏叶2g +10ml酶提取液研磨 4000rpm、30min 取上清液 加硫酸铵至饱和度38% 9000rpm、15min 取上清液 加硫酸铵至饱和度75% 9000rpm、15min 取沉淀 溶于2ml酶抽提液 透析,纯化 离子交换层析-DEAE纤维素 (1)称取DEAE纤维素52干粉11.5g,加20ml的0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)浸泡4h以上(或浸泡过夜)。 (2)装柱:把预处理的DEAE纤维素52装柱。装柱完成后,用23个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱平衡该柱。 (3)上样:把所得的酶洗脱液小心地注入柱床
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