生化测量系统的校准,南京121216.ppt
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1、生化测量系统的校准,南通大学附属医院 王惠民,一、与校准相关的一些基本问题,校准(Calibration)重要吗? 实验室中测量不合格约15%由校准误差所致 临床医生往往认为检验结果的“不准”是由不正确的校准造成的 陈文祥主任认为,检验结果互认的前提是: 测量结果是否具有可比性(溯源,方法性能评价:校准) 可比性的标准 参考测量区间(一致化问题),校准受到重视了吗? 一般由组长进行校准 一般无SOP,或SOP不够详细 CLSI或去其他的国际组织尚未有相应的标准或指南 一般的实验室无校准的记录 科主任一般不过问校准的正确与否,校准什么? 测量仪器?测量系统(“调标”或“定标”)? 测量仪器:单独
2、或与辅助设备组合,用于测量的装置。 测量系统:由一台或多台测量仪器所组成的用于特定测量的成套系统,包括试剂和电源等。 校准实际上就是将测量系统与“参考系统”进行比较,并将测量系统调整至参考系统相一致水平的过程。,实际上,有些情况下不需要对测量系统进行校准 临床化学测量常根据系数进行计算 例:酶催化活性浓度的测量,F值又称为K值,校准K值与理论K值的比较,DiaSys Randox,为什么用校准品后得到的K值与理论K值不一致? 校准品是如何定值的? 方法不一样(参考方法) 仪器不一样(最好的仪器,每次定值前都必须对仪器进行校准) 试剂不一样(最好的试剂),参考方法与常规方法测量仪器的差异,二、校
3、准前的准备,1.生化分析仪的准备 生化分析仪的校准或检定 生化分析仪的性能验证 2.试剂的准备 试剂是否获准入 试剂的性能验证 3.水的准备,1.生化分析仪的准备 生化分析仪的校准或检定 由厂家根据其标准对生化分析仪进行校准 由有关计量部门根据国家标准(JJG494-2005)对仪器进行检定,生化分析仪的性能验证(根据中华人民共和国生化分析仪检定规程JJG 494-2005进行) 零点漂移 波长准正确度及重复性 杂散光 吸光度正确度 吸光度重复性 吸光度线性误差 交叉污染率 温度正确度 比色杯间差距,生化分析仪检定用标准物质,用于吸光度正确度与重复性检定的标准物质 杂散光检定的标准物质 吸光度
4、线性检定的标准物质 交叉污染检定的标准物质 中国计量科学研究院,北京市北三环东路18号,电话:010-64524710,64278838,零点漂移,开机30min, 用蒸馏水调吸光度至0.000处,10min内吸光度的最大变化值应符合下表规定:,复兴仪器的零点飘移,复兴仪器340nm零点漂移,复兴仪器340nm零点漂移,复兴仪器405nm零点漂移,复兴仪器405nm零点漂移,复兴仪器340/405nm零点漂移,复兴仪器340/405nm零点漂移,复兴仪器405/505nm零点漂移,出现零点飘移可能原因,电压不稳 光电倍增管或光接收元件老化 仪器灵敏度过高 仪器设计与制造的缺陷,波长的正确度,波
5、长正确度的测定方法根据分光原理不同而异 分光式仪器(光栅由于不需传动调节波长,一般不需校准) 低压汞灯、氘灯、干涉滤光片 镨钕滤光片、氧化钬滤光片 滤光式仪器 将滤光片拆下在已校准的分光光度计上进行波长扫描,测定波长和半波宽 一般仪器不容易拆卸,特征谱线,低压汞灯: 253.7nm 氘灯: 486nm、656.1nm 镨钕滤光片: 529nm、808nm(400nm900nm内至少有10个吸收峰) 氧化钬滤光片: 200700nm共12条谱线 干涉滤光片: 长波通滤光片: 2001100nm,光学分辨率为1nm 短波通滤光片: 400700nm,光学分辨率为1nm,波长的重复性,指多次波长测试
6、数据的离散性,或者多次波长测试数据的符合程度。 一般取波长正确度的3次测试结果中最大值与最小值之差作为波长重复性。,波长正确度及重复性的要求 (nm),杂散光,杂散光与波长的半波宽有关,半波宽越大,杂散光越多。 测定50g/L亚硝酸钠(NaNO2)标准溶液相对于蒸馏水在340nm处的吸光度,了解杂散光的多少。 亚硝酸钠溶液的配制方法 将分析纯亚硝酸钠固体试剂放入称量瓶置于烘箱中,在箱温为1055下烘2h,取出置于干燥器中冷却至室温,在分析天平上(精度为0.1mg)精确称取10g,置于200mL烧杯中,用小半杯蒸馏水溶解后移入200mL容量瓶中,以少量蒸馏水冲洗烧杯三次,均倒入容量瓶中,然后用蒸
7、馏水稀释至刻度线反复摇匀,置于阴凉干燥处备用。,杂散光,1)在波长340nm,第一个试剂位放入蒸馏水,以蒸馏水为样本,重复测定5次吸光度值;第二个试剂位放入NaNO2溶液,以NaNO2溶液为样本,重复测定5次吸光度值;或将蒸馏水和NaNO2溶液分别加入同一比色杯读取吸光度(可消除比色杯误差),重复测定5次,共得5个蒸馏水和5个NaNO2溶液的吸光度。 2)最小NaNO2溶液吸光度-最大蒸馏水吸光度2.3。,复兴仪器的杂散光测定,复兴仪器的杂散光测定,复兴仪器的杂散光测定(空白),吸光度正确度,指吸光度实际测定值与理论值之差,该偏差越小吸光度正确度越高,间接说明波长的正确度与杂散光的多少。 1)
8、国家标准物质法 2)己糖激酶法,吸光度正确度,1)国家标准物质法: 使用国家标准物质研究中心制备的标准物质溶液,其吸光度分别为0.5和1.0。 在340nm波长、比色杯光径1cm时,以标准物质标示的参比液作参比,测吸光度值,重复测量3次。 计算3次测量值的算术平均值与标准值之差,0.5的标准液允许误差为0.025, 1.0 的标准液,允许误差为0.07。,测定结果,标准物质的吸光度:A1-1=0.489 A1-2=0.980 (不确定度:0.005) 检测结果: A1-1=0.4916;0.4836;0.4812,均值为0.4855 A1-2=0.9703;0.9714;0.9722,均值为0
9、.9713 结果判定:A1-1误差0.025;A1-2误差0.07。即 0.464A1-10.514;0.910A1-21.050,吸光度正确度,2)己糖激酶法 用己糖激酶(HK)法测定葡萄糖浓度时,反应产生NADH,在340nm 测定吸光度,间接测NADH的(理论值为6220),以此为标准校正。 以HK测葡萄糖为例,试剂反应过程如下: HK 葡萄糖+ ATP-6-P-葡萄糖+ ADP, G6PDH 6-P-葡萄糖+ NAD+-葡萄糖酸+NADH,影响吸光度准确度的主要因素,杂散光多 波长不正确 标准液不正确 仪器的灵敏度或其他原因,吸光度重复性,1)以重铬酸钾标准溶液为样本,在波长340nm
10、,吸光度为0.30.5,以蒸馏水为空白,试剂量为全自动生化分析仪标称的最小试剂量、测定时间为10min;每30秒读取吸光度,连续20次,得到20个吸光度值。计算CV,应1.0% 2)采用吸光度约为0.5生化分析仪用吸光度标准物质,在340nm处连续测定5次,然后计算其中最大值与最小值之差。吸光度的重复性均应不大于0.005,检测结果: A1-1=0.4828;0.4831;0.4836;0.4812;0.482 0.4836-0.4812=0.00240.005,吸光度线性误差,分别用浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g/L的氯化钴标准溶液,以蒸馏水为对照,在510nm(500-5
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