聚合酶链反应.ppt
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1、聚合酶链反应,(一)PCR技术(聚合酶链反应) 原理:PCR技术实际上是DNA体外扩增技术,其原理为: 以提取的DNA为模板,在94解链变性后提供单链DNA模板(模板变性) 将特定设计的与待扩增DNA模板两端序列互补的两个引物(短链互补DNA引物)经低温退火使引物与模板DNA互补结合(模板与引物退火连接) 在PCR反应中,在Taq酶(DNA聚合酶)作用下,使加入的游离单核苷酸(dNTPs)由引物5 3方向按碱基配对原则,沿DNA模板形成两条互补DNA链。(引物沿模板互补延伸)如图 新合成的DNA链又可作为下一轮PCR反应的模板,这种经热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环,经反复多次循环可
2、产生2n的指数扩增,使微量模板达可见量用于实验。 其引物设计、 PCR反应条件、仪器稳定性、技术性强,对环境要求严,以防假阳性产生。,PCR种类:种类多、用途多而广泛,列举常用法 逆转录PCR(RT-PCR):又称RNA-PCR 先将从细胞总提取的总RNA,在逆转录酶的作用下合成cDNA(序列用mRNA)以提供PCR模板。然后以cDNA为模板在互补的两个引物的引导下,在Taq酶作用下,将加入的dNTPs按碱基配对原则,沿cDNA 模板扩增DNA(见上图) 优点:只需少量mRNA 模板cDNA cDNA中已不含内含子 对构建cDNA文库非常有利 锚定PCR:当mRNA cDNA后,用末端转移酶在
3、cDNA3末端加上poly(dG)作锚位,然后用带有酶切位点的poly(dC)作锚定引物 ,进行PCR扩增。 优点:可克隆和扩增未知的DNA/RNA、基因序列,便于组装,免受基因两端序列限制。,反向PCR:能将位于已知基因序列两侧的未知序列(转座子、插入序列、易位整合的插入基因)扩增获得。 方法:选择已知序列内部没有该酶切位点的内切酶,对DNA进行酶切,经环化后,将环化分子用与已知序列两端的互补反向引物进行PCR扩增,可获大量的未知DNA片段,进一步测序。(图) 反向PCR 对研究转座子、反转录病毒插入序列以及所有可以整合或转位到基因组(已知序列)中的插入序列DNA片段(如原癌基因)。,随机引
4、物PCR 以合成一系列不同随机排列的寡核苷酸链(通常为10聚体)为引物,对基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物经丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳,EB染色显条,分析DNA多态性。 此法可通过扩增产物DNA片段多态性,可分析基因组相应区域的DNA多态性,被命名为随机扩增的多态性DNA(RAPD)。 RAPD可用于基因组指纹图的构建,可应用于系统进化研究、物种鉴定和亲缘关系分析,法医可用来作亲子鉴定。,单链构象多态性PCR(SSCP) 不同肿瘤由于单链DNA分子中因单一核苷酸不同,其DNA的二级结构的构象有差异。 PCR产物电泳后的DNA迁移率不同,其电泳条带上有差异。通过比较DNA的电泳类型,即可测出基
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