聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction.ppt
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1、聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction,上海第二医科大学 检验系 樊绮诗,PCR技术,由美国Cetus公司K.Mullis 于1983年建立 能在体外复制已知序列的DNA片段 具有扩增效率高和特异性强的特点 为生命科学领域的研究开创了崭新时代,PCR原理,d.NTPs,耐热DNA聚合酶,引物,添加反应混合液 及样本,变性,退火,加入试管中,延伸,继续延伸,循环,PCR原理,第二个循环 4个拷贝,第三个循环 8个拷贝,第n个循环 2n个拷贝,PCR原理,PCR的反应体系,参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和 缓冲液等。,PCR的反应
2、条件,反应温度(变性、退火、延伸) 反应时间(变性、退火、延伸) 循环次数(PCR效率及产物量),变性温度和时间,模板DNA充分变性是PCR顺利进行的前 提。在PCR扩增开始的第一次变性时, 应给 予足够的时间和温度,使基因组DNA充分变 性。一般在940C变性510 min。进入循环反 应后以94变性3040s, 足以使模板DNA双 链变性。,退火温度和时间,PCR反应的特异性取决于退火时引物 模板的特异结合。退火温度一般低于引物 Tm50C左右,退火温度越高,产物的特异 性也越高;被扩增片段越大,退火所需时 间也相应延长。,延伸温度与时间,延伸温度设为72, 因为Taq DNA聚合 酶在7
3、2时具较高的酶促活性,有利于DNA 的复制。延伸时间视产物长度而异,时间过 长易导致非特异性扩增。,模 板 (template),模板就是将要被复制的核酸片段(包括基 因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体DNA 等) 模板DNA须有较高的纯度 模板加入量影响PCR效率和产物的特异性,引 物(Primers),化学合成的寡核苷酸 能与模板特异地结合 引物决定产物的特异性和长度 引物设计时必须遵循一些原则,引物设计基本原则,PCR反应的引物需要二条,分别设在被 扩增目的片段的二端,并分别与模板正 负链序列互补 引物的长度一般以1825个核苷酸为宜 二条引物之间(尤其在3端)的序列不 可有互补,以
4、免形成引物二聚体 引物的碱基组成应平衡,避免出现嘌呤、 嘧啶碱基堆积,引物设计基本原则,引物的3端尤其要避免重复的CG碱基序列 二条引物的Tm值不能差别太大 Tm=2(A+T)+4(C+G) 合成引物时在其5端可以加修饰成份 设计引物最好用电脑软件进行分析,脱氧核苷三磷酸(dNTP),是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度,但非特异 性扩增也随之增加,DNA聚合酶,从一种生活在热泉(8090)中的水栖 噬热菌(Thermus aquaticus, Taq)中提取, 有很高的耐热稳定性 Taq 酶的作用:
5、 催化DNA合成。即在模板指导下,以dNTP 为原料,在引物3-OH末端加上脱氧单核苷 酸,形成3, 5 -磷酸二酯键,使DNA链沿 53方向延伸,镁离子浓度,镁离子浓度是一个至为关键的因素,对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性十分重要 虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关, 但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及 鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离 Mg2+的浓度从而影响酶的活性。,配制PCR反应体系(例),其它反应因素,pH应保持在酶反应所需的最适pH 盐浓度(引物与模板杂交率、杂交体稳定性 及聚合酶的活性) 二甲亚砜(DMSO)能破坏模板的二级结构
6、 牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶 的活性,循环次数,重复次数一般设为2535个循环 35个循环以后由于反应体系中各种反应组分的消耗和反应副产物的产生,此时扩增产物量不再随 循环次数的增加而呈指数增长,即反应已处于平 台期,指数增长期 线形增长期 平台期,循环数 #,PCR过程的实时监测,相对定量PCR,设计相对定量PCR实验方案时须注意: 预先确定最佳模板量和PCR循环数,使所 采用的各反应参数在扩增指数范围内,避 免平台效应。 “管家基因”与靶基因同管扩增,扩增产物 的长度应有所不同,以保证电泳能将两者 分离开。,绝对定量 PCR 外参照系统的设置 内参照系统的设置,实时定量 P
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- 聚合 链式反应 PolymeraseChainReaction
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