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1、Advanced Enzyme Engineering 第九章 生物酶工程 Contents 一、生物酶工程的定义 二、生物酶工程的内容 三、生物酶工程的前景 Go Go Go 生物酶工程是酶学和以基因重组技 术为主的现代分子生物学技术相结合的 产物,亦称高级酶工程(Advanced Enzyme Engineering)。 一、 生物酶工程 1. 定义 二、 生物酶工程的内容 (3) 从蛋白质或基因水平上设计,合成酶杂合 体或自然界不曾有的酶(杂合酶)。 生物酶工程主要包括: (1) 用基因工程技术大量生产酶(克隆酶); (2) 修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶); (4) 抗体酶; (5)
2、 核酶。 通过基因工程手段,克隆各种天然酶的基因, 将其克隆到表达载体中,然后将表达载体转化到适 当的宿主中,得到表达特定酶的基因工程菌,通过 基因工程菌的繁殖大量产生的酶称为克隆酶。 1. 克隆酶 (1)克隆酶的定义: 克隆酶图例 基因工程菌 载体 宿主 生物体 发酵 克隆酶 酶基因 外源基因转入微生物宿主细胞内,与宿主 细胞的遗传物质相结合,后代宿主的遗传物质 中含有外源基因,这种带上人工赋予的新的遗 传特性的宿主微生物,被称为基因工程菌。 2. 基因工程菌的定义 (1)在宿主细胞内可以自主复制; (2)克隆酶对载体的要求 (2)容易引入受体细胞; (3)具有合适的筛选标记基因; (4)具
3、有少数限制性酶切位点。 (3)克隆酶对宿主的要求 (1)安全可靠,非致病菌; (3)有利于酶的分离和纯化; (5)容易培养和管理。 (4)能利用廉价的原料,发酵周期短,产量高; (2)外源基因在宿主内能够表达且不被分解; (4)克隆酶基因的表达系统 o原核生物的基因表达系统 o真核生物的基因表达系统 1. 酵母表达系统 2. 植物表达系统 3. 动物表达系统 4. 丝状真菌表达系统 纤维素酶基因工程菌的构建 (5) 克隆酶实例 v 纤维素酶 纤维素酶在食品、饲料、造纸、纺织等行 业具有广泛的用途。但由于天然纤维素酶产量 低、来源有限而导致其大规模应用受到限制。 纤维素酶(cellulase)是
4、能将纤维素水解 为葡萄糖等简单糖类的一组酶的总称。 | 为此,通过基因工程技术,克隆福寿螺体内 的纤维素酶基因,构建含有cel的基因工程菌, 以期通过液体培养或固体培养的方式得到大量 的克隆纤维素酶。 afp基因 转化受体低温筛选 l技术路线1 A.bgpd L.egpd V.vgpd + 表达 载体 PEG介导转化 农杆菌介导转化 电激转化 分子鉴定 原生质体 或菌丝球 建立转 化体系 低温筛选 体系建立 l技术路线2 Cel基因工程 菌株的筛选 液体 发酵 分离纯化 定义:利用有控制地对天然酶基因进行剪 切、修饰或突变,从而改变这些酶的催化 特性、底物专一性或稳定性,使之更加符 合人们的需
5、要。 2. 突变酶 遗传修饰改变酶的性能大致有: (1)提高酶的活性 (2)提高酶的稳定性 (3)改变底物专一性 (4)改变酶的最适pH值 (5)改变酶对辅酶的要求 (6)改变酶的别构调节能力 修饰酶基因的方法主要方法 (i)定位突变 (ii)体外定向进化 定位突变(site-directed mutagenesis)是根 据酶的结构、功能和作用机制的信息,在基因水 平上精确改变酶分子中的氨基酸残基,对酶的性 质和其催化特性进行改造,产生符合特定需要 的酶。 (i)定位突变 l盒式诱变 l寡聚苷酸引物诱变 lPCR诱变 方法: (1)盒式诱变 o原理:利用一段人工合成的具有突变序列的寡聚核甘
6、酸片段(寡核甘酸盒,Oligonucleotide Cassette), 取代野生型基因中的相应序列。 HindIII EcoRI HindIII EcoRI + (2)寡聚苷酸引物诱变 o原理:用化学合成的含有突变碱基的寡核甘酸短片段 作为引物,启动单链DNA分子进行复制,生产出来 的新链中目的基因的特定位点具有已经发生突变的碱 基序列。 A 转化 G T A G A ATCGCTTCT A C T A G G C T A P标记筛选分 离突变体 (3)PCR诱变 o定点诱变法 o大引物诱变法 特点:可以在DNA区段的任何部位产生定点突变。 o原理:在头两轮的PCR反应中,应用两个互补的并在
7、 相同部位具有相同碱基突变的内侧引物,扩增形成两 条有一端可彼此重叠的双链DNA片段,两者在其重叠 区段具有同样的突变。故此两条双链DNA片段经变性 和退火处理,形成两种不同形式的异源双链分子。然 后选用两个外测寡核甘酸引物进行第三轮PCR扩增, 可得到一种含有突变位点的突变体DNA。 5 35 3 靶DNA片段 55 33 混合、变性、退火 定 点 诱 变 法 5 3 5 3 大引物诱变法 5 5 3 3 大引物 PCR PCR PCR 多次循环PCR 一理论来源 o利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程 n化学进化 n生物进化 (ii)体外定向进化 人为地创造特殊的进化条件,模拟自
8、然进化 机制,在体外对基因进行随机突变,从一个或 多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为获得 的)出发,经过基因的突变和重组,构建一个 人工突变酶库,通过一定的筛选或选择方法最 终获得预先期望的具有某些特性的进化酶的分 子进化技术称为体外定向进化。 体外定向进化 定向进化示意图 细菌 诱发突变的 因素 50 0C培养 突变体库 选择压力 (温度) 温度耐受型突 变体 最适生长温度为 37 0C 最适生长温度提高了! 随机突变+定向选择目标突变体 Strategies for the development of effective enzymes 定向进化 n属于蛋白质的非合理设计,它不需要事先
9、了解酶 的空间结构和催化机制,人为地创造特殊的进化 条件,模拟自然进化机制(随机突变、基因重组 和自然选择),在体外改造酶基因,并定向选择 (或筛选)出所需性质的突变酶。 定向进化随机突变选择 澄清一个事实:定向进化不是定点突变 o定向进化:突变 筛选 突变位点是随机的,不确定的; 突变位点的数目也是不确定的; 突变的效应更是不可预知的; 理论上讲,凡是能够引起突变的因素(物理的,化学的, 生物的)都可以应用于定向进化中突变体的产生。 o定点突变: 突变位点是确定的,突变的个数也是预知的; 突变的效应可能是已知的,也可能是未知的; 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。 易错PCR技术(e
10、rror-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling):由美国Stemmer 于 1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发发重组组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了 一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP):由Zhao 等 提出, 是一种 简化的DNA shuffling 技术 随机突变的策略 易错PCR 易错PCR:是一种简单、快速、廉价的随机突变方法。 原理:利用TaqDNA聚合酶不具备3-5校正功能的特点 通过改变PCR的条件,通常降低一种dNTP 的量(降 至5%-10%)使PCR易于出错,达到随机突变的目的 。还可以加入dITP 来代替被减少的
11、dNTP,又会使下 一轮循环中出现更多的错误。在PCR 缓缓冲液中另加入 Mn2+,亦有利于提高突变变率。 DNA改组 DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR (sexual PCR),原理如图所示。 PCR扩增 体 外 定 向 进 化 成功实例 Lipase genes (lipB52, lipB68) isolated from Pseudomonas fluorescens B52、B68 Genbank Accssion number AY623009、AY694785 成功实例 Zhengbing Jiang, Yitao zheng, Yu Luo, Gang Wa
12、ng, Hongping Wang, Yushu Ma and Dongzhi Wei*. Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From Pseudomonas fluorescens B52. Molecular Biotechnology. 2005 ( 31), 095-102. SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purification ofunctional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
13、 体外随机引发重组 体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模板,配合一 套随机序列引物,先产生大量互补于模板不同位 点的短DNA片段,由于碱基的错配和错误引发,这 些短DNA片段中也会有少量的点突变,在随后的 PCR反应中,它们互为引物进行合成,伴随组合, 再组装成完整的基因长度。 交错延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并 为一步, 缩短其反应时间,从而只能合成出非 常短的新生链,经变性的新生链再作为引物与 体系内同时存在的不同模板退火而继续延
14、伸。 此过程反复进行,直到产生完整的基因长度。 交错延伸 定向进化是一个由构建突变体库,突变体表达, 表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程,需要 : (1) 产生包含大量带有微量有利突变的突变体的 文库; (2) 突变体应能在适当的微生物(如大肠杆菌或酵 母菌) 体内进行功能的表达; (3) 必须有一种灵敏的筛选方法,能反映出由一个 氨基酸的置换而引起的预期性状的较小提高。 环境库和噬菌体展示库的构建 环境库的构建: (1)采集环境样品; (2)提取DNA,连接到合适的载体上; (3)转入合适的宿主菌。 噬菌体展示库的构建 在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因,形 成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白
15、的表面,被展 示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和 生物学活性。 噬菌体展示的基本原理: 利用靶分子,采用适当的淘洗方法(亲和洗脱 扩增亲和的循环步骤),洗去非特异结合的噬菌体, 最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体 ;外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,而其编码基 因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测 序出来,使得表达蛋白(表现型)和编码基因(基因型 )之间完美地结合起来。 噬菌体展示库的构建步骤: o可分为选择(selection)和筛选(screening)。 o选择:通过添加或减少某种成分使目的菌株获得生长优势,而其 它菌株的生长受到抑制,通过多次的筛
16、选分离最终得到目的菌株 。 o检测:通常是在培养基中加入某种试剂或化学药物,使培养后发 生某种可以辨别的变化,如培养基的透明度的变化或菌落周围颜 色的变化,由此区别不同类型或生理特性不同的微生物。(容易 实现高通量筛选) 定向进化的筛选策略 琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌,通过宿主菌的生长 情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养,挑取具有活性的克 隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。 微球细胞固定法 与数字成像系统结合,将单个细胞附着在单个 固体珠上,突变体进行分离和筛选。 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后,通过高速流动系
17、统,排成 单行,逐个通过流式细胞计数仪进行测定。 突变体分离 通过酶促反应的特征 加入底物显色 荧光共振能量转移 同位素标记底物 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测 酶检测 信号探测 分光光度计和荧光酶标仪 气相色谱和高效液相色谱 质谱和核磁 目标酶所需功能方法结果实施菌种 卡那霉素核苷基 转移酶 热稳定性定位诱变+选择在60-50酶半衰期增 加200倍 耐热脂肪 芽孢杆菌 枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60二甲基亚砜主 仆女冠活力增强170倍 枯草杆菌 -内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime的抗性 增加32000倍 大肠杆菌 对硝基苯酯酶有机溶剂中的
18、底 物特异性和活性 易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌 胸苷激酶第五特异性 基 因理疗 交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌 -半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特 异性增加1000倍 大肠杆菌 砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌 定向进化的应用 3. 杂合酶 杂合酶是把来自不同酶分子中的结构单 元或是整个酶分子进行组合和交换,以产生 目的所需的优化酶杂合体。 杂合酶的构建策略: (1)二级结构的互换; (2)功能域替换; (3)融合蛋白。 杂合酶的制备方法: (1)同源扫描突变; (2)反-内蛋白子的应用; (3)DNA增长截短法; (
19、4)同源基因的改组SCRATCHY库。 同源扫描突变:几个同源酶PCR扩增,然后用内切核 酸酶切割,不同的切割产物混合组合,Taq聚合酶扩增 ,含有几个同源蛋白质的基因片段组成新基因,即为杂 合基因,进而克隆与表达,产生杂合酶。 反-内蛋白子的应用:反-内蛋白子能够融 合任何两个多肽,适合产生杂合酶。 DNA增长截短法:应用DNA增长缩短法,定向控制DNA 的消化,不要求任何DNA的同源性和酶的结构知识,理 论上两个基因的所以组合都可能产生,通过选择或筛选 ,找到目标酶。 同源基因的改组SCRATCHY库:增长剪截与 DNA随机重组相结合。 四、生物酶工程的前景 随着各种高新技术的广泛应用及酶工程研究工作 的不断深入,生物酶工程研究必将取得更快、更大的发 展。可以相信,将来人们可以,采用生物学方法在生物 体外构造出性能优良的产酶工程菌为生产和生活服务, 酶工程技术必将在工业、医药、农业、化学分析、环境 保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面发挥越 来越大的作用。
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