生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1).ppt
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1、3.1 酶的制备及活力测定,实验目的和要求 1.掌握盐析法制备活性蛋白质的原理及方法。 2.掌握过氧化物酶的活力测定方法。,辣根过氧化物酶的制备及活力测定,实验原理,过氧化物酶催化以下反应 2H 2 O 2 O 2 +2H 2 O 这一类酶以铁卟啉为辅基,所以属血红素蛋白质类 (hemeproteins)。过氧化物酶在生物界分布极广,在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。,实验原理,辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase,简称HRP,EC.1.11.1.7)是植物中研究得最深入的一种过氧化物酶,早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离此酶,以后又制备出结晶。本实验
2、是以辣根为原料,经过水的抽提,硫酸铵和丙酮分级分离,再经锌离子纯化,透析除盐,冰冻干燥,便可得到高纯度的辣根过氧化物酶。,实验原理,辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质 ,Mr在40 000左右,等电点7.2。溶于水,溶解度为5%(W/V),溶液呈棕红色,透明。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液,而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下,HRP几周内稳定,加热到63,在15min内稳定。氧化还原电势很低,pH6.08时,E 0 =-0.2070V,pH为7.71时,E 0 =-0.2787V。 ,辣根过氧化物酶的活力测定方法,1.RZ值:提
3、纯工作的后几步,以及纯酶溶液可用RZ值表明酶的纯度。RZ= A403nm/A275nm,403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收,275nm的吸收是蛋白质的吸收,结晶的HRP的RZ值为3.04。测定时的酶浓度为1mg蛋白/mL。 2.愈创木酚法:测k4。以愈创木酚(邻甲氧基酚,guaiacol)为氢给体,其反应产物四邻甲氧基连酚.有色产物四邻甲氧基连酚生成的速度(dx/dt)与底物过氧化氢及氢给体愈创木酚的浓度有关。 本实验是采用测定 k4的方法来判断酶的纯度。,实验步骤,一、 HRP的制备 1.水提取:称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP),用菜刀切成小碎块,在绞肉机中绞
4、碎12次。碎渣浆用1倍体积的水低温下搅拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干,收集滤液,碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取1次,合并2次滤液,测得总体积。,实验步骤,2.硫酸铵分级分离:在不断搅拌下,每1 000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉末(相当于0. 40饱和度,0),大约在12h内加完,置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出,下面混浊液以3 000r/min离心15min,弃沉淀,合并上清液。再按每1 000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌,当硫酸铵全部溶解后,置冷室过夜。次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰冻离心机中以13 000
5、r/min离心20min,弃去上清液,收集沉淀。将沉淀悬浮于100150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止),分装于透析袋内,放在流动自来水中进行透析12天,直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析,中间更换23次,用0.1mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并,在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min,弃去沉淀,量上清液的体积。,实验步骤,3.丙酮分级分离:将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中,在不断搅拌下,用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至15的丙酮,放置片刻,在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min,弃去沉
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