第15章核酸的研究方法.ppt
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1、第15章 核酸的研究方法,Nucleic Acid,制备天然核酸必需采用温和的条件,防止过酸、过碱,避免剧烈搅拌,尤其重要的是防止核酸酶的作用,一、核酸的分离、提纯和定量测定,真核DNA以核蛋白(DNP)形式存在,DNP溶于水或高盐溶液(1mol/L NaCl),但不溶于低盐溶液(0.14mol/L NaCl 去除蛋白质:水饱和酚,氯仿异戊醇。 DNA沉淀:0.3M NaAC-70%乙醇,(一)DNA分离纯化,制备RNA时,最重要的是使RNase灭活: 所有容器都要经过高温处理,不能高温高压的用0.1焦碳酸二乙酯(DEPC)处理。 加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活; 在RNA的反应体系内
2、加入RNase的抑制剂(如RNasin),(二)RNA的分离,(三)核酸含量的测定,2、定糖法 RNA:核糖 糠醛 绿色物质(670-680nm) DNA:脱氧核糖+二苯胺兰色物质(595-620nm),苔黑酚/地衣酚,浓HCl,浓硫酸,1、紫外吸收法 1个A50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA,3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸 4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比,纯DNA 比值1.8, 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0, 2.0 DNA、 P
3、r、苯酚污染,(四)、核酸纯度的测定,OD260OD280,二、核酸的沉降特性与超速离心,不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋),密度和沉降速率不同,用密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来,8M CsCl,45000rpm,16h 密度梯度:1.80g/ml1.55g/ml 平衡时:浮力密度=CsCl密度=离心力 =0 +4.22(r2 - r02) 10-10 :浮力密度 :角速度(弧度/秒) r:样品到转轴的距离,(一)核酸密度的测定,G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 =0.1 xG-C + 1.658 xG-C =(-1.658) 10,(二)测定DNA的G-
4、C含量,RNADNA 变性DNA双链DNA 蛋白质, 变性程度越大,浮力密度越大,(三)研究核酸的构象,(四)用于核酸的制备,超螺旋DNA或,用于大片段DNA的分离,精度低,但分离范围广。,三、核酸的凝胶电泳,(一)琼脂糖凝胶电泳,用于小片段DNA的分析 相对分子质量小于1000bp的DNA片断和RNA的电泳。 PAGE中一般不含RNase,用于RNA分析时不会分解样品。,(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),(一)DNA的酶法测定,四、核酸的核苷酸序列测定,英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构,1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法,1980 获诺贝尔化学奖 合成一
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