酶的提取和分离纯化.ppt
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1、11 酶的提取与分离纯化,暨南大学食品科学与工程系 包惠燕 ,食品酶学-包惠燕-11,思考题,1.酶提取纯化过程中应注意些什么? 2.酶提取前进行的预处理包括什么? 3.酶提取过程 中为什么要破细胞?破细胞的方法有哪些?其中哪些可用于大规模生产? 4.酶的抽提剂中常见成分的作用? 5.酶和其它蛋白质的分离常依据哪些性质差异?分别有哪些主要的分离方法? 6. SDS-PAGE指什么?试述其原理和应用。 7.试述亲和色谱原理,画出示意图。,本章主要内容,酶的提取、纯化的基本原则 细胞破碎 酶的抽提 浓缩与初步提纯 酶的分离纯化方法 酶的纯化步骤 酶纯化步骤的定量评价 酶的提纯标准及剂型,11. 酶
2、的提取、分离纯化,酶的提取、分离纯化是将酶从细胞或培养基中取出,再与杂质分开,而获得与使用目的、要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程 酶的提取包括以下内容: 材料的选择及前处理 破细胞 抽提 浓缩与初步提纯,11.1 酶的提取、纯化的基本原则,一、防止变性失效 二、可以采用比一般蛋白质分离更多更有效的方法和条件 三、提取、纯化的每一步都应进行酶活力的检测 采用的方法应兼顾酶的回收和提高酶产品的比活力,注意点,1.除了少数例外,所有操作都应在低温下条件下进行,尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心 2. 大多数酶在pH 10的情况下不稳定,故必须控制整个系统不要过酸或过碱;同时要避免在调节pH时产生
3、局部酸碱过量的现象。 3.酶和其它蛋白质一样,常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性,故操作中应尽量减少泡沫形成。 4.重金属、有机溶剂等能使酶变性失效,微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏,所有这些也都应予以足够的重视。,酶分离纯化的工艺流程设计,设计时需要考虑的因素: 酶源材料 前期工艺过程 产品对纯度的要求 酶存在的状态 设备条件 动力、原料成本及工时费用,酶分离纯化的工艺流程设计,合理的工艺应以降低成本,提高效能,同时又提高产品纯度和质量为前提。 对一个方法好坏的评价标准是: 1.酶的回收率 2.酶产品的比活力,材料选择及其前处理,动物材料:事先剔除结缔组织、脂肪组织 植物材料:果
4、实种子事先去皮壳,油质种子用乙醚等脱脂 微生物发酵物:先将菌体和发酵物分离 胞外酶 酶 胞内酶 结酶 溶酶,11.2 细胞破碎,除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之外,大多数酶都存在于细胞内,因此提取和分离纯化前须将进行细胞的破碎。 破碎细胞的方法有: 机械法,物理法,化学法和酶法,11.2.1 机械破碎法,指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法,常用的有如下几种: 1.机械捣碎法 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。10000r/min 此法在实验室和生产规模均可采用。 2.研磨法 利用研钵、石磨、球磨(不锈钢或玻璃珠直径0.2-1.0mm)、细菌磨等研磨器械所产生的
5、剪切力将组织细胞破碎,必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂。 此法效率较低,机械破碎法,3.匀浆法 利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成,也可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来破碎那些易于分散,比较柔软,颗粒细小的组织细胞。 此法细胞破碎程度较高,对酶的破坏也较少,但难于在工业生产上应用。,11.2.2 物理破碎法,通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用,使组织细胞破碎的方法,统称为物理破碎法。此法多用于微生物细胞的破碎,1.温度差破碎法,通过温度的突然变化使细胞破碎。 例如将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中,或将较高温度中的细胞突然冷冻都可使细
6、胞破坏。 此法对较脆弱的细胞效果较好。但难以应用于工业化生产。,2.压力差破碎法,通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差法等。 (1)高压冲击法是在结实的容器中装入菌体细胞和冰晶、石英砂等混合物,用活塞或冲击锤加高压冲击之,使细胞破碎。冲击压力可达每平方厘米几百至几千kg。,Manton-Gaulin homogeniser valve,压力差破碎法,(2)突然降压法是将菌体装进高压容器中,加压至30MPa以上,打开出口阀,使菌体悬浮液经阀门流出,出口处压力突然降为常压,由于膨胀而使细胞破碎。 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压容器中,用氮气或二氧化
7、碳加压到几十至几百大气压,振荡几分钟,使气体扩散到细胞内,然后突然排出气体,压力骤降,使细胞破碎。,压力差破碎法,(3)渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来,再悬浮在20%左右的蔗糖溶液中平衡一段时间,然后离心收集细胞,迅速投入4左右的蒸馏水或低渗溶液中。由于细胞外渗透压突然降低,而使细胞破碎,将细胞中的酶等物质释出胞外。 此法适用于膜结合的酶、细胞间质酶等的提取。可用于从海洋微生物中提取某些酶。但对G+菌不适用。,3.超声波破碎法,利用超声波的机械振动而使细胞膜上所受张力不均而破碎。,Fig. Sonicator,11.2.3 化学破碎法,
8、这是应用各种化学试剂与细胞膜作用,使细胞膜的结构发生改变或破坏的方法。 常用的试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。,(1)有机溶剂处理,有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏,从而改变细胞膜的透过性,再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。 常用的有机溶剂:甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。,(2)表面活性剂处理,表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用,使细胞结构破坏,增加膜的透过性。 在酶的提取方面一般采用非离子型的Triton、Tween等表面活性剂。 表面活性剂处理对膜结合酶的提取特别有效,在实验室和生产中均已成功使用。,11.2.4 酶学破碎法,在一定条件下,通过外加的酶或细胞本身存在的酶
9、的作用,使细胞破碎。 1.外加酶处理 根据细胞外层结构特点,选用适当的酶,使细胞壁破坏,并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。 如溶菌酶能专一作用于肽多糖的-1,4-糖苷键,常用于G+ 菌的细胞破碎。 -葡聚糖酶用于酵母细胞的破碎。 几丁质酶用于霉菌的细胞破碎 纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶往往混合使用,作用于植物细胞的细胞壁。,2.自溶法,将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下保温一段时间,通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏,使胞内物质释出的方法称为自溶法。 必要进可加入甲苯、氯仿、叠氮钠等杀菌剂 此外可通过加入噬菌体去感染细胞,或通过电离辐射等方法,使细胞自溶。,丙酮干粉的制备,破细胞等处理后可将材
10、料制成丙酮干粉(acetone powder),一般程序是: 先将材料粉碎、分散,然后在0以下的低温条件下,加入510倍预先冷至约-20 的丙酮,迅速搅拌均匀,随即过滤,最后低温干燥,研磨过筛。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁,另一方面有利于除去大量的脂类杂质,同时还能使某些膜结合酶易于溶解。此外,丙酮干粉含水量低,便于保存。,11.3 酶的抽提(萃取、提取),酶的抽提是指在一定条件下,用适当的溶剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程。 抽提的要求是将尽可能多的酶,尽量少的杂质从原料引入溶液。 酶抽提时首先应根据酶的性质和溶解性质,选择适当的抽提液。抽提液的具体组成和抽提条件取决于酶的溶解
11、性、稳定性以及有利于切断酶和其他物质的联系。,抽提剂,由于大多数酶属于球蛋白类,一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱溶液。但抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。,抽提剂的组成,破碎生物组织一般在适当的缓冲液中进行,典型的抽提剂由以下几部分组成: 离子强度调节剂(如KCl, NaCl,蔗糖)最普通的有0.0200.050mol/L的磷酸缓冲液,0.15mol/L的NaCl溶液等。 pH缓冲剂 通常以选用pH46为佳 温度效应剂(如甘油,二甲亚砜) 蛋白酶抑制剂(如PMSF苯甲磺酰氯,DIFP二异丙基氟磷酸) 防氧化剂(如巯基乙醇) 重金属络合剂(
12、如EDTA,柠檬酸) 增溶剂(如TritonX-100,去氧胆酸盐),11.4 浓缩与初步提纯,1.浓缩 抽提液和发酵液中的酶的浓度一般都很低,所以在纯化前往往须先加以浓缩。沉淀法可浓缩并去除部分杂质,此外,浓缩的方法有 (1)蒸发法 (2)反复冻融法 (3)胶过滤 (4)超滤法,2.初步提纯,除去大分子的核酸和粘多糖 (1)加硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或MnCl2可使核酸沉淀移去。必要时使用核酸酶。 (2)常用醋酸铅、乙醇、单宁和离子型表面活性剂等处理解决,有时也用酶。 经过初步提纯,余下来的大分子为酶与杂蛋白,分离纯化的主要工作,同时也是比较困难的工作,就是将酶从杂蛋白中分离出来。,
13、11.5 酶的分离纯化方法,现有的酶的分离纯化方法都是根据酶和杂蛋白在下列性质上的差异建立的。 性质 方法 分子大小 离心,超离心法、凝胶过滤, 膜分离技术(超滤,反渗透, 微孔过滤,透析,电渗析等) 溶解度 盐析法,有机溶剂沉淀法,共沉淀法, 选择性沉淀法,结晶 电荷或基团 离子交换色谱,电泳,等电聚焦, 吸附 色谱,疏水色谱,聚焦色谱 稳定性 选择性变性法(热,酸碱, 表面活性剂) 特殊(专一性结合) 亲和色谱,亲和洗脱,亲和电泳,酶的分离纯化方法,根据溶解度不同进行的纯化 按分子大小进行的纯化 根据电学解离性质不同进行的纯化 利用专一亲和作用进行的纯化 根据稳定性差别建立的纯化方法,11
14、.5.1 根据溶解度不同进行的纯化,盐析法 有机溶剂沉淀法 共沉淀法 选择性沉淀法 等电点沉淀法 液液分离法,一、盐析法,盐析法是最古老的,但也是目前仍广泛采用的方法。 盐析法根据的原理是:球蛋白在低盐浓度的溶液中,溶解度随盐离子强度升高而增大,表现“盐溶(salting in)”的特性。但是当盐浓度继续升高,并超过某一上限时,其溶解度又会先后以不同速度下降,分别“盐析(salting out)沉淀析出。盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别差别而建立的一种纯化方法。,球蛋白溶解度-溶液离子强度关系,盐析,中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因: 1).中和蛋白质分子表面电荷 2).
15、与蛋白质颗粒竞争水分子 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不同,因而可以分级沉淀。 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋白质浓度在1mg/ml以上,低温。 此法优点:简便,安全,重现性好 缺点:分辨率低,纯度提高不显著,同时为了下一步纯化,有时还需要脱盐。,盐析,盐析法的一个发展就是和色谱技术相结合形成盐析色谱法(salting out chromatography),即以琼脂糖等非极性物质为柱色谱的支持体,在高浓度条件下将样品中的蛋白质盐析吸附,然后再梯度地降低盐类浓度,使酶和杂蛋白分别洗脱出来。 这种技术的优点是纯化量大,重复性好,分辨率高较。,盐析,蛋白质和酶在溶液中的溶解度
16、,与溶液中的离子强度有关: Log(S/S0)=-KsI LogS=LogS0-KsI=- KsI S-蛋白质或酶在离子强度为I 时的溶解度(w/v) S0-蛋白质或酶在离子强度为0时的溶解度 Ks-盐析常数 I -离子强度,盐析,在一定的温度和pH条件下(为常数),通过改变离子强度的方法可使不同的蛋白质或酶分离,称为KS分段盐析。 在一定的盐和离子强度条件下(Ks、I为常数 ),通过改变温度或pH值使不同物质分离,称分段盐析。,二、有机溶剂沉淀法,有机溶剂能降低溶液的介电常数,增加蛋白质分子间的静电引力,导致蛋白质的溶解度下降;也可与水作用使蛋白质脱水而趋于凝集、沉淀。利用不同蛋白质在不同浓
17、度的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法称有机溶剂沉淀法。 应考虑: 温度 pH 离子和离子强度 有机溶剂 此法优点:分辨率高,溶剂易除去。 缺点:温度控制不当时易引起变性。,有机溶剂沉淀法,用于蛋白质纯化的有机溶剂中,丙酮的分离效果最好,引起失效的情况比较少。除丙酮外,乙醇和甲醇等也常用。有机溶剂浓度通常以百分体积表示,加入量可按下式计算:V = Vo* (S2-S1)/(S-S2) V 应加入的有机溶剂体积 Vo原溶液的体积 S2所要达到的有机溶剂百分浓度 S1原溶液中有机溶剂的百分浓度 S待加有机溶剂的百分浓度,三、共沉淀法,利用离子型表面活性剂如SDS、非离子型表面活性剂如聚乙二醇(pol
18、yethylene glycol, PEG)、聚乙烯亚胺以及单宁酸、硫酸链霉素等,在一定条件下能与蛋白质直接地形成络合物,使蛋白质沉淀析出,然后再用适当方法使需要的酶溶解出来,除去杂蛋白和沉淀剂,从而达到纯化的目的。,共沉淀法 例子,以聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)纯化限制性内切核酸酶RE. EcoR I为例。 在该酶生产菌株的超声破碎离心上清液中,包含大量的DNA和杂蛋白。PEI在0.2mol/L KCl的条件下,能和DNA以及与之相关的蛋白质一起凝聚沉淀析出;但当KCl的浓度上升至0.6 mol/L时,虽然PEI与DNA及杂蛋白仍处于沉淀状态,而RE. EcoR
19、I却能重新溶解,因此可将酶和杂蛋白分离开来,使RE. EcoR I得到初步纯化。,四、选择性沉淀法,某些多聚电解质如聚丙烯酸(PAA)、硫酸糊精以及磷、砷、硅的钨、钼、钒等的杂多酸常能在极低的浓度条件下选择性地和某种或某类酶结合沉淀析出,其选择性的机制尚不清楚。 e.g.,PAA对某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有选择性沉淀效果: PAA+酶 PAA-酶 PAA-酶+Ca2+ PAA-Ca +酶+2H+ PAA-Ca +SO42- CaSO4 +PAA,五、等电点沉淀法,等电点沉淀根据的原理是,蛋白质的溶解度随分子间引力增大而变小,当其他条件相同时,分子间的引力在蛋白质处于等电点状态最大,因而容
20、易沉淀析出。 由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度,沉淀往往不完全,故而一般很少单独使用,更多的是作为其它沉淀法中的一个组合条件,但此法有时可用于对付杂蛋白种类较多的样品:将pH调整至某一值后,不仅会使处于等电点状态的蛋白质沉淀,也可使处于等电点两侧带相反电荷的杂质形成复合物而沉淀,从而可除去大量杂蛋白。,等电点沉淀法,如:纯化动物材料抽提液中的酶时,可将pH先调整至5左右,待放置片刻后,核蛋白等颗粒杂质就会沉淀析出,使酶溶液达到“一步澄清”。 又如:纯化血清胆碱脂酶时,可先将pH先调至2.83.0,除去酸性杂蛋白。 调整溶液的pH时应选用具有相同离子的酸或碱缓冲液。,六、液液分离法,双相水溶
21、液分离法(aqueous two-phase separation) 利用酶和杂蛋白在不相混溶的两相系统中分配系数不同而达到纯化目的。 通过选择两相系统中多聚物的种类与浓度、系统的pH、离子和离子强度以及温度,就有可能使酶和杂蛋白达到很好的分离。 优点:条件温和,适于大量样品的纯化 缺点:成本高,纯化后还须除去介质带来的多聚物。,双相水溶液分离法(aqueous two-phase separation),以聚乙二醇(PEG)和右旋糖酐形成的两相系统为例。上相主要是PEG,下相为右旋糖酐。分配系数K=C上/C下 酶和蛋白质的通常介于0-1.0之间。 lnK=*M/(kB*T) M待纯化物质的分
22、子量 系统的特性常数 kBBoltzmann常数 绝对温度,11.5.2 按分子大小进行的纯化,凝胶过滤(色谱)法 超过滤法(筛膜分离法) 超离心分离法,一、凝胶色谱,原理:各种分子大小不同,因而进入颗粒状凝胶内微孔的能力不同。 把适当的凝胶颗粒装填成色谱柱,当欲分离的物质通过柱时,分子量不同的物质在柱中的流动受到固定相的阻滞作用不同,分子量大的只能沿溶胀的凝胶颗粒间的空隙随溶剂流动,移动速度较快,先流出柱外,分子量小的可渗入凝胶网孔而受阻滞,流程长,移动速度慢,迟流出色谱柱。,凝胶色谱,凝胶色谱,凝胶色谱,常用的商品胶主要有: 葡聚糖凝胶sephadex 聚丙烯酰胺凝胶Biogel 琼脂糖凝
23、胶sepharose 商品胶都给出对球蛋白的最适分段分离范围,凝胶色谱,凝胶和柱的选择是根据被分离物分子量的大小进行: 1).分离分子量相差较大的两类物质,选择大分子能被排除,小分子能渗入的凝胶,柱长:直径 5:1至15:1 2).分离分子量相差较小的物质,则根据待提纯物的大约分子量,查看分离范围,选择适当型号的凝胶。柱长:直径 20:1至100:1,凝胶色谱,A 分子直径最大孔径,全排出 B 最小孔径分子直径最大孔径 能进入部分凝胶的内孔隙 C 分子直径最小孔径 能进入凝胶的全部内孔隙 A、C类不能分离,B类可分级分离,二、膜分离技术,原理:利用膜的借助于一定孔径的各种高分子薄膜,将不同大小
24、、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术,统称为膜分离技术。 超滤:具有分子筛效应,能用于酶等大分子物质的分离、浓缩、纯化,操作简单,条件温和,但只能达到粗分的要求,且不适于需要小分子辅酶的酶。 操作压力:50700kPa,超滤膜截留的颗粒直径2200nm,相当于分子量1500kD。,膜分离技术,透析,三、离心,离心是借助于离心机旋转所产生的离心力,使不同大小和不同密度的物质分离的技术。 在酶的提取和分离纯化过程中,细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。 超速离心机的最大转速达2500080000r/min,最大相对离心力达500000g,甚至更高。超离心法只
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