第4章基因重组和基因工程ppt课件.PPT
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1、,天津医科大学生化教研室 解 用 虹,重组DNA技术,教学要求,熟悉基因工程(重组DNA技术)产生的理论 和技术基础,以及基因工程开展的积极意义。 2. 掌握以质粒为代表的载体的结构特点和实际应用。 3. 掌握以限制性核酸内切酶为重点的一系列工具酶和宿主细胞的概念,特点和实际应用。 4. 熟悉完整的基因工程的过程,步骤和原理。 5. 了解重组DNA技术在医学中的应用和其广泛应用前景。,重组DNA技术,第一节 概述 第二节 重组DNA基本原理 第三节 重组DNA技术在医学中 的应用,第一节 概述,一. 基因工程建立和发展的 基础 二. 面临新挑战,解决新问 题 三. 相关的基本概念,一. 基因工
2、程建立和发展的基础,1. 分子生物学的理论发展 DNA结构和功能的深入认识 遗传信息中心法则的确立 2. 分子生物学的技术进步 限制性内切酶等工具酶的发现 载体的发现和构建 3. 分子生物学的发展要求 基因的结构和序列 基因功能和调节 新DNA分子的构建,二. 面临新挑战 解决新问题,1. 基因的结构 2. 基因的功能 3. 基因表达调节 4. 基因工程产品 5. 构建新基因,三. 相关的基本概念,1. 克隆 2. 目的基因 3. 载体 4. 工具酶 5. 宿主细胞,1.克隆(clone ),1.克隆是指来自同一始祖的一群相同分子(如DNA)、细菌(如大肠杆菌)、细胞(如杂交瘤细胞)或动物(如
3、羊)的集合。 2.这种由单一始祖获取大量副本或拷贝的过程称为克隆化 3.分子生物学和分子遗传学所涉及的分子克隆专指DNA克隆,2.目的基因( target DNA ),1. 目的基因就是我们感兴趣,待研 究或应用的基因,目的基因又称 目的DNA. 2. 目的基因可分为两种类型 基因组DNA cDNA (互补 DNA),3. 载体( vector),1. 载体的概念 2. 载体应具备的特征 3. 常见的基因工程载体,. 载体的概念,载体是指能够容纳目的基因而且具有自我复制能力,同时又能携带目的基因进入宿主细胞,并能大量扩增目的基因或能表达有意义的蛋白质的DNA分子。前者称克隆载体,后者称表达载体
4、。,. 理想载体应具备的特征,1. 自身含有复制子,具有自主复制的能力 2. 在宿主细胞能够稳定地遗传 3. 有合适的分子量,易于操作但又能容纳较大分子的目的基因,同时便于与宿主染色体分离 具有便于应用的多克隆位点,便于目的基 因的插入 5. 具有一个或多个遗传标致作为筛选标记 作为表达载体应具有与宿主细胞相适应的 启动子等调节元件,. 常用的基因工程载体,质粒 噬菌体 黏粒 病毒 穿梭质粒 其他载体:( BAC和 YAC ),. 质粒 ( plasmid ),1. 质粒是存在于细菌染色体外的, 具有在宿主细胞内自主复制能力的环状双链DNA分子。 2. 工程质粒载体不是天然质粒,是 人工构建的
5、质粒。通过人工构建赋予了质粒许多作为基因载体的特征。,质粒(plasmid) 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数 千碱基对。常 有 1 3个抗药 性 基因,以利于 筛 选。,质粒载体的基本特征,1. 具有复制起始点和自主复制能力 2. 细胞分裂时,能稳定地遗传给子代 3. 带有独特的遗传信息(抗药性等) 4. 具有酶切位点(携带外源 DNA) 5. 分子量远小于染色体(便于分离) 6. 一般可接受小于10 Kb的外源基因,克隆载体pUC18/19,表达载体pGEX-3X,. 噬菌体 ( bacteriophage ),1. 噬菌体是细菌病毒,它可以感染 细菌。 2.
6、噬菌体由基因组DNA和包装蛋白质组成。 3. 噬菌体DNA一般可有双链线状DNA (如噬菌体)和单链环状DNA(如M13),. 其它载体,黏粒 病毒 穿梭质粒 其他载体:( BAC和 YAC ),4. 工具酶,1.工具酶是能对基因进行加工和处理的酶类 2.常用的工具酶有 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 逆转录酶 其它的工具酶, 限制性核酸内切酶,1. 定义 2. 分类 3. 命名 4. 酶切位点 5. 酶切末端,.限制性内切酶-定义,1. 能识别和切割DNA双链内部特异 核苷酸序列的一类核酸内切酶。 2. 核酸内切酶是原核细胞识别和破坏外源DNA分子的初级免疫形式。 3. 原核细
7、胞具有限制性/甲基化系统,通过甲基化保护自身的DNA不被破坏,. 限制性内切酶分类,1. 限制性内切酶可分为三类: 类,类和类。 2. 基因重组技术中使用的是类。 3. 类限制性内切酶的酶切位点多在识别的序列内。,. 限制性核酸内切酶命名,EcoR E co R 1. 核酸内切酶命名一般由四部分组成。 2. 第一部分一个斜体的大写英文字母表示来源菌的属(Escherichia )。 3. 第二部分二个斜体的小写英文字母表示来源菌的种( coli ) 4. 第三部分正写英文字母表示来源菌的株R 5. 第四部分大写罗马数字表示发现的顺序,. 酶切位点-回文结构,1. 类核酸内切酶识别位点或称识别序
8、列多为回文结构 2. 所谓回文结构即DNA的两条链从5向3 阅读时具有相同的序列 3. 如 Hin d Bam H,. 酶切末端,1. 经核酸内切酶切割后可产生二类末端:黏性末端和平端 2. 黏性末端可分为 5突出黏性末端和 3突出黏性末端,限制性核酸内切酶作用后产生两种末端: 钝性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end),5-端突出 粘性末端 3-端突出 限制性核酸内切酶识别序列长度为48个bp。 不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端(compatible end),可用连接酶连接。,. DNA聚合酶,1. DNA聚合酶是以DNA为模板合成DNA的聚合酶 2. DNA聚合
9、酶只能催化DNA 3羟基与 dNTP 5磷酸基间3,5磷酸二酯键的形成,不能催化d NTP间的连接 3. TaqDNA聚合酶是从嗜热水生菌分离获得的DNA聚合酶,广泛应用于PCR.,. DNA连接酶,1. DNA连接酶是催化二个DNA片段之间相连接的酶,是催化一个DNA片段的3羟基和另一个DNA片段的5磷酸基间形成35- 磷酸二酯键的酯化连接酶 2. DNA连接酶既能连接黏性互补末端,也能连接平端 3. 基因工程中常用的是T4DNA连接酶, . 逆转录酶,1. 逆转录酶是以为RNA模板指导合成 DNA的DNA聚合酶 2. 逆转录酶广泛应用于cDNA的合成 3. 基因工程中常用的是从鸟类骨髓瘤母
10、细胞病毒获取的逆转录酶,简称AMV (Avian Myeloblastosis Virus),. 其它的工具酶,1. 碱性磷酸酶 2. 多核苷酸激酶 3. 末端转移酶,5. 宿主细胞,宿主细胞分为原核细胞与真核细胞,由于原核细胞操作简单,遗传背景清楚,故常用的为大肠杆菌等原核细胞。 宿主细胞特别是宿主菌要安全,不会造成疾病的传播。 具有限制酶和重组酶缺陷。 操作简便。 5. 常用的大肠工程菌: E. coli DH5,第二节 重组DNA的基本步骤,一. 目的基因的获得与修饰 二. 载体的选择与修饰 三. 目的基因与载体的连接 四. 宿主细胞的选择与处理 五. 重组体的导入与筛选和鉴定 六. 重
11、组基因的表达,重组DNA技术基本步骤,一. 目的基因的获得与修饰,目的基因的获得 . 化学合成DNA片段 . 基因组DNA的制备 . 反转录合成cDNA . PCR扩增DNA片段,2.目的基因的修饰,. 选择限制性内切酶并酶切 . 导入适宜的酶切位点 . 末端修饰加入互补末端,目的基因的获取 1. 化学合成法 用于已知序列,或可推导出序列的基因 2. 基因组DNA 基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),基因组DNA文库 存在于转化细
12、菌内, 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合。 简称G文库。,cDNA文库 用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后, 建立的基因文库。简称 c文库。,PCR是根据DNA复制的原理,在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。 PCR的反应体系:模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP及含有Mg2的缓冲液。,外显子拼接法扩增人ApoC成熟肽编码基因,限制性核酸内切酶作用后产生两种末端: 钝性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end),二. 克隆载体的选择与修饰,1. 克隆载体的选择 . 克隆载体或表达载体 . 插入片段的大小 . 实验室的条件
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