第5章蛋白质的分离纯化.ppt
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1、第5章 蛋白质的分离纯化,本章主要内容,蛋白质的性质 蛋白质分离和纯化 蛋白质的分离步骤 蛋白质的纯化方法 蛋白质含量的测定 蛋白质纯度等的测定,蛋白质的两性离解和电泳现象 蛋白质的胶体性质 蛋白质的沉淀作用 蛋白质的变性 蛋白质的紫外吸收,一、蛋白质的性质,一、蛋白质的性质,蛋白质与多肽一样,能够发生两性离解,也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI),蛋白质的溶解度最小,在电场中不移动。 在不同的pH环境下,蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中,蛋白质粒子带负电荷,在电场中向正极移动;在等电点偏碱性溶液中,蛋白质粒子带正电荷,在电场中向负极移动。这种现象称为蛋
2、白质电泳(Electrophoresis)。,1 蛋白质的两性离解和电泳现象,电泳,蛋白质在等电点pH条件下,不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象,可以将蛋白质进行分离纯化。,由于蛋白质的分子量很大,它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质,如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜,因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,2 蛋白质的胶体性质,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件,将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下,蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,3 蛋白质的沉淀作用,在温和条件下,通过改变溶液的p
3、H或电荷状况,使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中,结构和性质都没有发生变化,在适当的条件下,可以重新溶解形成溶液,所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法,如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,3 蛋白质的沉淀作用,可逆沉淀,在强烈沉淀条件下,不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性,而且也破坏了蛋白质的结构和性质,产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化,所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,3 蛋白质的沉淀作用,不可逆沉淀,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某
4、些物理或化学因素,能够破坏蛋白质的结构状态,引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。,4 蛋白质的变性,蛋白质的变性,变性蛋白质通常都是固体状态物质,不溶于水和其它溶剂,也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以,蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此,大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质,可以对蛋白质进行定性鉴定。,5 蛋白质的紫外吸收,二、蛋白质分离和
5、纯化,研究蛋白质的结构、性质和功能,首先需要得到纯的蛋白质样品。 (1)蛋白质来源:微生物细胞、动物细胞和植物细胞; (2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。 (3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。,1蛋白质的分离步骤,(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。 (2)根据蛋白质的特性,选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提,酸性蛋白用稀碱性溶液抽提,脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后,可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理,得到蛋白质粗制品。 (4)精制:可用层析法、电泳法等进行精制。 (5)成品加工:测定蛋
6、白质的性质并干燥成成品。,2蛋白质的纯化方法,根据蛋白质的亲水胶体性质,当其环境发生改变时,蛋白质会发生沉淀作用(Precipitation)。 因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同,所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。 沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。,(1)沉淀法,沉淀法 膜分离法 萃取法 层析法 电泳法,2蛋白质的纯化方法,2蛋白质的纯化方法,蛋白质在高浓度的中性盐溶液中,由于水化层被破坏和表面电荷被中和,容易发生沉淀 阴离子化合物的效果是:NH4+K+Na+ 阳离子化合物的效果是:PO43-SO42-Cl- 常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷
7、和水化程度不同,盐析时所需的盐的浓度也不相同,因而可以将不同的蛋白质加以分离。,(1)沉淀法,盐析,2蛋白质的纯化方法,在蛋白质溶液中,加入一定量的与水互溶的有机溶剂,由于这些溶剂与水的亲和力强,能够破坏蛋白质的水化层,使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性,有机溶剂浓度不能太高(30%-50%),而且需要在低温条件下进行。,(1)沉淀法,有机溶剂沉淀法,2蛋白质的纯化方法,蛋白质分子在等电点时,净电荷为零,分子之间的静电排斥力最小,因而容易聚集形成沉淀。 当蛋白质混合物溶液的pH 被调到某一成分的等电点时,则该蛋白质大部或全部将沉
8、淀出来。而那些等电点高于或低于该pH 的蛋白质仍然留在溶液中。 该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。,(1)沉淀法,等电点沉淀法,2蛋白质的纯化方法,Dialysis此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜,而使它与其它小分子化合物,如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。 常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料,截止分子量一般为一万。,(2)膜分离法, 透析法,2蛋白质的纯化方法,透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内,再将透析袋放入透析液(通常是蒸馏水或缓冲液)中进行透析。 通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。,(2)膜分离法, 透析法,2蛋白质的纯化方法,超过滤技术是
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- 蛋白质 分离 纯化
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