蛋白表达纯化20110419.ppt
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1、北京康为世纪生物科技有限公司 Beijing CoWin Biotech Co.,Ltd. 康为世纪 原核表达及纯化 蛋白表达流程 序列分析 表构建达载体 蛋白表达 蛋白纯化 蛋白检测 原核表达 非融合型表达载体 融合型表达载体 - 带标签的表达载体(His 、GST) 具有编码不同多肽的标签序列,为定位、检测或纯化目的蛋白提供方便。 若蛋白较小可加入融合标签,促进蛋白正确折叠。 - 分泌型表达载体 可使外源基因产物直接分泌到大肠杆菌的外周腔,减少在胞内表达且表达产物 对细菌的毒性,同时外周腔中的蛋白酶活性低,有助于提高融合蛋白的稳定性。 原核生物表达系统 优势:遗传背景清楚、表达量高、产物易
2、纯化、使用范围广。 劣势:原核表达系统翻译后修饰体系不完善,表达产物活性低。 原核表达 目的基因的获取 选择载体、构建重组表达质粒 转化受体菌 重组体的筛选鉴定 I 重组表达载体克隆 1. 目的基因获取: 基因组DNA、mRNA反转录cDNA、人工合成 2. 常用载体 : His标签: pET系列(pET28a、pET32a)、pQE系列 GST标签:pGEX系列 3. 构建重组质粒: 选择合适的内切酶位点、酶切、连接 4. 转化感受态细胞: 热击法转化非表达型感受态菌 5. 重组体的鉴定: 阳性抗药克隆菌落PCR 阳性抗药克隆提质粒、酶切鉴定 测序 原核表达 转化表达菌株 优化诱导条件 表达
3、蛋白检测 放大培养 I I 蛋白诱导表达 1. 表达菌株选择:(pET系统) 常规表达菌株:BL21 表达毒性蛋白:BL21pLys 适合表达真核基因:Rosseta(BL21衍生菌,补充大肠杆菌缺少的6种稀有密码子) 2. 诱导表达 pET系统采用T7启动子,诱导剂:IPTG 诱导要素:IPTG浓度、诱导温度、诱导时间 设置阴性对照:未加IPTG诱导 3. SDS-PAGE、WB检测,确定目的蛋白 未诱导、诱导后的全菌、诱导后上清、诱导后沉淀 包涵体表达及增加蛋白可溶性 优化诱导条件,增加蛋白溶解性 在 E.coli中表达的重组蛋白经常以不溶的、无活性蛋白聚集体的形式表达,被称作包涵体。即使
4、在形成 包涵体时,还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于pET 系统的高表达水平,即使有大量的目的蛋白聚集形 成包涵体,也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下,降低蛋白合成速率,如降低诱导培养温 度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。 诱导和培养条件:37(包涵体), 30,低温(15-20)诱导过夜, IPTG浓度,诱导后的培养条件 细胞周质定位:选择带有信号肽的载体(pET12/20/22) 宿主菌:尝试可表达真核蛋白的Rosseta菌株 裂解缓冲液:普通的Binding buffer中一些疏水或膜结构蛋白会是不溶的,但如果 加入非离子去污剂就会变成可溶。 表达载体选择 标
5、签选择: 6XHis: - 适合任何表达系统 - 纯化后不需切割标签 - 纯化简单,也可纯化包涵体蛋白 - 小标签对重组蛋白折叠影响小 GST:谷胱甘肽巯基转移酶 - 适合任何表达系统 - 相对可增加蛋白的可溶性 - 纯化后需切除标签 - 标签蛋白可能会形成二聚体 标签蛋白 : 优点 - 可以提高蛋白的可溶性和稳定 性。 - 用亲和层析的方法对蛋白进行纯化 , 采用通用的检测标签的方法。 缺点 - 标签可能对蛋白的结构、折叠和生物 学活性有影响。 - 切除标签时,酶切效率不会达到 100%,会有氨基酸残余。 His标签: pET系列 常规表达载体:pET28a、pET32a、pQE系列 周质腔
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