蛋白质分子基础蛋白质一级结构测定.ppt
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1、蛋白质化学,蛋白质一级结构的测定,序列测定的基本方法学,将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。再将不同方法得到的序列进行比对,就可以得到肽链的一级结构。,序列测定一般步骤,纯度要求:纯度在97%以上。 双向电泳;凝胶电泳;N-末端测定;纯化至恒定酶活; 肽谱分析。 分子量测定 多肽链的组成,二硫键的断裂。 蛋白质的氨基酸的组成。 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析 进行正常的序列测定*,蛋白质和肽的氨基酸组成,蛋白质的水解,酸水解 6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸,105-110水解20小时。 优点:不容易引起水解产物的消旋化。 缺点:Trp被沸酸完
2、全破坏; 有-OH的Ser或Thr小部分被分解; Asn和Gln侧链的酰胺基-COOH。 注:加入0.1-1%巯基乙醇和0.05-0.1%苯酚, Tyr或Thr收率提高,碱水解 5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 缺点: 水解过程中许多AA都受到不同程度的破坏,产率不高。 水解产物发生消旋化。 优点:Trp在水解中不受破坏。,蛋白质的水解,磺酸水解 4mol/L甲基氨酸(含0.2%-吲哚乙胺)色氨酸可回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸,再用过量的连四硫酸钠氧化,得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性,条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合
3、物时,色氨酸容易被破坏。 优点:中性水解液可以直接上机,色氨酸稳定。,蛋白质的水解,磺酸水解 4mol/L甲基氨酸(含0.2%-吲哚乙胺)色氨酸可回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸,再用过量的连四硫酸钠氧化,得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性,条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时,色氨酸容易被破坏。 优点:中性水解液可以直接上机,色氨酸稳定。,蛋白质的水解,蛋白质的水解,酶的水解 选用专一性低、水解酶活力高的蛋白酶水解,可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。 优点: 其他水解不稳定的氨基酸,如Trp、Asn、Gln等,都可以用此方法。 缺点:
4、 不容易彻底水解,也许回收率。 蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。,氨基酸的分离与含量测定,特殊氨基酸的测定,色氨酸的测定,紫外吸收法 Trp与Tyr在280nm附近的光吸收成一定比例,可用方程计算出Trp的含量: 对二甲基氨基苯甲醛法 Trp在强酸条件下可与醛反应,产物在590nm下有最大吸收。此吸收值与Trp含量成正比。可用此法测量Trp含量。,巯基含量测定,DTNB法(5.5-二硫代双(-2-硝基苯甲酸) 反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收,根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含量。,Protein- +R-S-S-R(DTNB),Protein-SH,Protei
5、n-S-S-R+RS-,Protein-S-S-Protein+RS-(CNT),末端氨基酸的测定,N-末端的测定,sanger反应 Edman反应 丹磺酰氯(DNS)法 氨肽酶法,Sanger反应2、4二硝基氟苯(DNFB)反应,Edman反应-PITC与多肽的反应,Edman反应,苯异硫氰酸酯(PITC)法: 多肽 or 蛋白质末端NH2PITC PTC多肽 or 蛋白质 有机溶剂 N末端的PTCAA发生环化 生成苯乙内酰硫脲的衍生物 脱离肽链 除去N末端AA后剩下的肽链仍然是完整的。 (因为,PTC的引入,只使第一个肽键稳定性降低) 干 燥 / 薄层 气相 HPLC 层析 色谱,丹磺酰氯
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- 蛋白质 分子 基础 一级 结构 测定
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