重组DNA技术00002.ppt
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1、重组DNA技术,第二章,重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆,DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone,1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验:,从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质,并把每一种成分同活的R型细菌混合,悬浮在合成培养液中。结果发现只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌,重组DNA技术的发展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 O. T. Avery(1944年)证明,遗传信息的携带者是DNA; J. D. Watson和F. H.
2、 C. Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型(1953年) M. Meselson和F. W. Stahl证实了DNA的半保留复制(1958年) F. H. C. Crick提出遗传信息传递的“中心法则”(1958年) F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型(1961年) M. W. Nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码(1966年) 1972年,P. Berg等率先完成了DNA体外重组(1980年诺贝尔化学奖) 1973年,S. Cohen等进一步实现了重组DNA的转化 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司,专门应用
3、重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1982年,美国食品与药物管理局批准首例基因工程产品-人胰岛素 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,人体生长激素释放激素(SS),抑制和调节多种激素的作用,相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系,主要内容:,第一节、重组DNA技术相关概念 Concept Associated to Recombinant DNA Technology,克隆(clone):是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的群体
4、,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning),即无性繁殖。,(一) DNA克隆,技术水平:分子克隆(molecular clone) (即DNA 克隆) 细胞克隆 个体克隆(动物或植物),是在体外将不同来源的特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其它载体分子,构建重组DNA分子,然后将重组DNA导入到合适的受体细胞中,使其在细胞中扩增和繁殖(称之为“克隆”),筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子(recombinant DNA, chimera DNA) ,即DNA克隆,因此DNA重组技术又称为DNA克隆(DNA cloning)。,DNA克隆,生物技术工程
5、: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,又称重组DNA工艺学或重组DNA技术(recombination DNA technique),基因操作(gene manipulation)、遗传工程(genedc engineering)。,(二)目的基因,进行DNA重组的目的主要有两方面: 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质) 这些使我们感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因(target DNA)。 目的基因有两种类型: cDNA(complementary DN
6、A):在体外经反转录合成的与mRNA互补的DNA。 基因组DNA(Genomic DNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。,(三)载体,一.表达载体(expression vector): 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 二.克隆载体(Cloning vector): 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,第二节 重组DNA技术操作的基本过程,基本原理,重组DNA技术操作的主要步骤,重组DNA技术操作过程可形象归纳为:,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,以 质 粒 为 载 体
7、 的 DNA 克 隆 过 程,第二节 重要的工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,一.限制性核酸内切酶(restriction endonuclease),限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,定义:,第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写; 第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写; 第四个字母代表株; 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名:,Hin d,Ha
8、emophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,、(基因工程技术中常用型),分类:,型限制性核酸内切酶的作用特点 回文结构(palindrome) 大部分型限制酶能够识别由4个8个核苷酸组成的特定序列。型酶识别具有回文结构的核苷酸序列(图2-2)。“回文”意为顺读和倒读都一样的词语,切口 :平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,来源不同的限制酶,但能识别和切割同一位点,这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同功异源酶:,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA后,产生相同的粘性末端,称为同尾酶。这两个相同的粘性
9、末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,同尾酶,限制性内切核酸酶,二、DNA连接酶(基因工程的“缝纫针”) : 1. T4噬菌体DNA连接酶:两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端(Km=0.6mol/L)或平末端(Km=50mol/L)。 DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导 2. 大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的连接 三、DNA聚合酶 1.大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大肠杆菌DNA聚合酶I具有三种酶活性。 Klenow片段具有二种酶活性(去除5 3外切酶活性)。 2. Taq DNA聚合酶: 耐热(7
10、5-80),分子量65kD,也具5 3外切酶活性。 反转录酶(RDDP):多功能酶,无3 5DNA外切酶活性,具有3 5RNA外切酶活性。,第四节 常用载体,定义 载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。具备的条件: 具有自主复制能力 有多个单一限制性内切酶的酶切位点(MCS) 具有选择性遗传标记 分子量小 拷贝数高(10个200个/细胞) 具有较高的遗传稳定性。,常用载体: 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA,质粒 (plasmid):是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNA,能独立进行复制。,特点: 1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在,能在宿主细胞内独立自主复制;有较高的拷贝
11、数。 2.具有一个以上的遗传标志,便于在宿主细胞进行选择。 3.具有多个限制性酶的单一切口,称为多克隆位点。便于外源基因的插入。,常用质粒载体,(一) pBR322质粒:由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成,长度为4.36kb,特点: (1)含有复制起始点和复制调节信号; (2)有单个EcoRI酶切位点,可切开插入目的基因; (3)有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因 Amp+,便于重组体细胞的筛选。,(二) pUC系列载体:,由pBR质粒与M13噬菌体构建而成,长度为2.674kb,特点: 具有更小的分子量和更高的拷贝数。 “蓝白斑”筛选: pUC载体中的LacZ基因可编码-半乳
12、糖苷酶(-Gal)N端的-肽链,该-肽与宿主细胞(如E.coli JM109)中F因子上的LacZM15基因(-肽缺陷型)的产物互补,产生完整的、有活性的-半乳糖苷酶,分解生色底物(X-gal)形成蓝色菌落。当外源基因插入MCS后,LacZ-肽基因的读码框被破坏,不能合成完整的-半乳糖苷酶分解底物X-gal,菌落呈白色。称为“蓝白斑”筛选。,EcoR Sac Kpn Sma BamH Xba Sal Pst Sph Hind ,ori,pUC19质粒载体图,(三)其它质粒载体,1能在体外转录克隆基因的质粒载体: T7、SP6的启动子(RNA聚合酶附着位点) 2穿梭质粒载体(shuttle pl
13、asmid vector): 具有两种不同复制起点和选择标记,在原核和真核细胞之间往返穿梭.,(四)T-A克隆载体,多克隆位点两侧的3末端携带有未配对的T碱基。由于许多耐热的DNA聚合酶(如Taq、Tth等)扩增时都有在PCR产物3末端加上A碱基的特性,因此在连接酶的作用下可直接将PCR产物插入到T-A载体中。获取、连接外源DNA不受酶切位点的限制。,二、噬菌体载体,噬菌体是一类细菌病毒。 (一)噬菌体载体 1噬菌体的特点 线状双链DNA,全长48 502bp,由左右两臂组成,两端为12碱基组成的彼此完全互补的5单链突出黏性末端,称为cos位点。 感染细菌后,可进入溶菌生命周期及溶源生命周期。
14、 优点:可插入较大外源DNA片段(可达23kb);感染效率远高于质粒载体。,2噬菌体载体的构建,优点:可插入较大外源DNA片段(可达23kb);噬菌体的感染效率高,噬菌体作为载体用于分子克隆的示意图,DNA重组,体外包装,携带外源DNA 有感染性的病毒颗粒,感染大肠杆菌,(二)粘粒载体,结构与特点: 1含有cos黏性末端及与噬菌体包装有关的短序列 2含有抗药性标记(如Ampr基因)和自主复制成分 3具有限制性内切酶位点 4粘粒分子小 如pJB8为5.4kb,所以可插入大片段的外源DNA(可达45kb) 5某些粘粒若接上能在真核细胞生活的元件及选择标记,便可作为穿梭载体在真核细胞中生存及表达。,
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