第08章电泳技术hu.ppt
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1、第八章 电泳技术,第八章 电泳技术,第一节 电泳技术发展简史 第二节 电泳的基本原理 第三节 影晌电泳分离的主要因素 第四节 电泳的分类 第五节 各种电泳技术介绍 第六节 电泳测纯技术,第一节 电泳技术发展简史,1809年,俄国物理学家首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。 1909年,Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。,1937年,瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进,
2、创造了Tiselius电泳仪,建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法,并首次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成的,由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 1948年,Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法,对氨基酸的分离进行了研究。,上世纪50年代起,特别是1950年,Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后,开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。 1959年,Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极
3、大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:即“电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即“Last Check”。 上个世纪80年代发展起来的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。,第二节 电泳的基本原理,电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离
4、基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。,电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。,电泳过程必须在一种支持介质中进行。 Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质,所以扩散和对流都比较强,影响分离效果。 样品在固定的介质中进行电泳过程,减少了扩散和对流等干扰作用。 支持介质:滤纸、醋酸纤维素膜、硅胶薄层平板、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。,电泳装置主要包括两个
5、部分:电源和电泳槽。 电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。 电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。 垂直板式电泳是较为常见的一种,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。,稀溶液中,电场对带电分子的作用力(F)等于分子所带净电荷量(q)与电场强度(E)的乘积。即: FqE 带电分子移动过程中,会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力(F)的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关,并与带电分子的移动速度成正比,对于球状分子,F的大小服从Stoke定律,即:F=6r r是球状分子的半径,是缓冲液粘度(或介质粘滞系数),是电泳速度(单位:cm/s )。,当带电分子匀速移动时
6、: F = F qE = 6r =qE/6r 电泳迁移率(m):单位电场强度下的迁移速度: m = /E = q/6r 电泳迁移率与带电分子所带净电荷成正比,与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。,带电分子由于各自的电荷和形状大小不同,因而在电泳过程中具有不同的迁移速度,形成了依次排列的不同区带而被分开。 即使两个分子具有相似的电荷,如果它们的分子大小不同,由于它们所受的阻力不同,因此迁移速度也不同,在电泳过程中就可以被分离。 有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离,如等电聚焦电泳; 有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离,如SDS-聚丙烯酰胺凝
7、胶电泳。,第三节 影晌电泳分离的主要因素,3.1 待分离生物大分子的性质 3.2 缓冲液的性质 3.3 电场强度 3.4 电渗 3.5 支持介质的筛孔,3.1 待分离生物大分子的性质 待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。 一般来说,分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快。 3.2 缓冲液的性质 主要是指电极溶液(缓冲溶液)和蛋白质样品溶液的pH值、离子强度和粘度等。,3.2.1 pH值 溶液pH值决定带电颗粒的解离程度,也即决定其带净电荷的量。 对两性电解质(如蛋白质)而言,溶液的pH值离其等电点越远,带净电荷量就越多,泳动速度就越快。
8、缓冲液pH还会影响到其电泳方向,当缓冲液pH大于两性电解质的等电点,两性电解质带负电荷,其电泳的方向是指向正极。 电泳时应选择适宜的pH值,并需采用缓冲溶液,使溶液的pH值恒定。,3.2.2 离子强度 为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性,缓冲液通常要保持一定的离子强度,一般在0.020.2。 离子强度过低,则缓冲能力差,往往会因溶液pH值变化而影响泳动的速率。 离子强度过高,会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层(即离子氛),由于离子氛与待分离分子的移动方向相反,它们之间产生了静电引力,因而引起电泳速度降低。,离子强度的计算公式为: I1/2mizi2
9、=1/2(m1z12+m2z22+mnzn2) I:溶液的离子强度; mi:离子的摩尔浓度; zi:离子的价数;1,2,n代表各种离子。 3.2.3 溶液粘度 泳动度与溶液粘度是成反比关系。粘度过大或过小,必然影响泳动度。,3.3 电场强度 电场强度(V/cm)是每厘米的电位降,也称电位梯度。电场强度越大,电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大,而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功(W)为: W=I2Rt I为电流强度,R为电阻,t为电泳时间。,电流所作的功绝大部分都转换为热,因而引起介质温度升高,这会造成很多影响: 样品和缓冲离子扩散速度增加,引起样品分离带的
10、加宽; 产生对流,引起待分离物的混合; 如果样品对热敏感,会引起蛋白变性; 引起介质粘度降低、电阻下降等等。,电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的,介质中心温度一般要高于外周,尤其是管状电泳,由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降,摩擦系数减小,电泳迁移速度增大,电泳分离带通常呈弓型。 电场强度或电极缓冲液中离子强度增高时,电流强度会随着增大。不仅降低分辨率,而且在严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶支持物。,电流强度过低,生热少,电泳时间延长,引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。 电泳实验中要选择适当的电场强度,同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。,3.4 电渗 当支持
11、物不是绝对惰性物质时,常常会有一些离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子,使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用下,此溶液层会向负极移动。反之,若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子,则溶液层会向正极移动。这种溶液层的泳动现象称为电渗。,电泳电场中,液体也会相对固体支持介质发生移动,出现电渗现象。在pH值高于3时,玻璃表面带负电,吸附溶液中的正电离子,引起玻璃表面附近溶液层带正电,在电场的作用下,向负极迁移,带动电极液产生向负极的电渗流。 当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时,则加快颗粒的泳动速度;当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时,则降低颗粒的泳动速度。,3.5 支持介质的筛孔 支持介质的
12、筛孔大小(如:琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔)对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。 在筛孔大的介质中泳动速度快,反之,则泳动速度慢。 除上述影响泳动速度的因子外,温度和仪器装置等因子的影响也应考虑。,第四节 电泳的分类,4.1 电泳按其分离的原理分类 4.2 按支持介质的分类 4.3 按支持介质形状分类 4.4 按用途分类 4.5 按所用电压分类,4.1 电泳按其分离的原理分类 区带电泳:电泳过程中,待分离的各组分在支持介质中被分离成许多条明显的区带,应用最广。 自由界面电泳: 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术,是在形管中进行电泳,无支
13、持介质,分离效果差,已被取代。 等速电泳:需使用专用电泳仪,电泳平衡后,各电泳区带相随,分成清晰界面,以等速向前运动。 等电聚焦电泳:两性电解质在电场中自动形成pH梯度,当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。,4.2 按支持介质分类 纸电泳(Paper electrophorisis) 醋酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis) 琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis,PAGE) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SD
14、S-PAGE)。,4.3 按支持介质形状分类 薄层电泳 ; 板电泳 ; 柱电泳。 4.4 按用途分类 分析电泳; 制备电泳; 定量免疫电泳; 连续制备电泳。 4.5 按所用电压分类 低压电泳:100V500V,电泳时间较长,适于分离蛋白质等生物大分子。 高压电泳:1000V5000V,电泳时间短,有时只需几分钟,多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。,第五节 各种电泳技术介绍,5.1 纸电泳(paper electrophoresis) 5.2 醋酸纤维薄膜电泳 5.3 琼脂糖凝胶电泳 5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 5.6 梯
15、度凝胶电泳 5.7 等电聚焦 5.8 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE) 5.9 毛细管电泳 5.10 免疫电泳 immunoelectrophoresis 5.11 细胞电泳 5.12 电泳应用法 ion(t)ophoretic administra-tion, electrophoretic administration 5.13 差异凝胶电泳,5.1 纸电泳(paper electrophoresis) 纸电泳是在渗透了缓冲液的滤纸上加上电场使物质移动的一种区带电泳法。也就是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。滤纸悬垂或水平地支在支持板上。 分辨率比凝胶介质
16、要差,但操作简单,所以仍有很多应用,特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。,电泳完毕记下滤纸的有效使用长度,然后烘干,用显色剂显色。 定量测定的方法有洗脱法和光密度法。 洗脱法是将确定的样品区带剪下,用洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。 光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的含量。,5.2 醋酸纤维薄膜电泳 与纸电泳相似,不同之处在于醋酸纤维薄膜为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯,溶于丙酮后涂布成的均一细密微孔的薄膜。 操作简单、快速、价廉,广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分
17、子,为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据,因而已成为医学和临床检验的常规技术。,正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1:清蛋白;2:1-球蛋白;3:2-球蛋白;4:-球蛋白;5:-球蛋白;6:点样原点,醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相比的优点: 对蛋白质样品吸附极少,无“拖尾”现象。 快速省时。亲水性小,吸水少,电渗作用小。 灵敏度高,样品用量少。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。 应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品,如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素等。 醋酸纤维薄膜电泳染色后,用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板,有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。,5.3
18、 琼脂糖凝胶电泳 天然琼脂(agar)是一种多聚糖,主要由琼脂糖(agarose,约80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。 琼脂胶是含硫酸根和羧基的强酸性多糖,在电场作用下能产生较强的电渗现象,加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷。,琼脂糖凝胶电泳优点: (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理就可以进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀,含水量大(约占98%99%),近似自由电泳,样品扩散较自由,对样品吸附极微,电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用
19、紫外光灯检测及定量测定。 (4)电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定。制成干膜可长期保存。,琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构,这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。 琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制,低浓度的琼脂糖形成较大的孔径,而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。 琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶,用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳,以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。,5.3.1 蛋白质的琼脂糖凝胶电泳 1的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说比较大,对蛋白质的阻碍作用较小。此时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小,适用于忽略蛋
20、白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术,如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。 常用琼脂糖作为电泳支持物,分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合,发展成免疫电泳技术,能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系;超微量技术,可检出0.1g蛋白质。,5.3.2 核酸的琼脂糖凝胶电泳 用于分离、鉴定核酸、提纯DNA片段等。如DNA鉴定,DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。 操作简单、迅速,能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物,分开的DNA可用低浓度的萤光染料(0.5g/ml溴化乙锭)染色,在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。 对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型,同
21、时与凝胶的浓度密切关系。,DNA迁移率取决于以下参数: DNA分子的大小 线状双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。 用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳,比较其电泳速率,可求出待测片段大小。DNA分子超过20kb时,电泳迁移率不再依赖于分子大小。,琼脂糖浓度 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。,DNA构型 不同构型DNA的移动速度次序为:供价闭环DNA(covalently closed circular,cccDNA)直线DNA开环的双链环状DNA。 琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率为0,而同等大小
22、的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进。,电压 低电压时,线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。 电压增高时,大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的,琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。 为了获得DNA片段的最大分辨力,凝胶电泳时电压不应超过5V/cm。,5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。,1:样品胶pH6.7 2:浓缩胶pH6.7 3:分离胶pH8.9 4:电极缓冲液pH8.3,聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面),夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线
23、接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统,凝胶模示意图,5.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的聚合 聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和甲叉双丙烯酰胺(N,Nmethylene-bisacylamide,简称Bis)聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。 常用的催化聚合方法有两种:化学聚合和光聚合。,化学聚合:通常是加入催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate, (NH4)2S2O8,简称AP)以及加速剂四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetramethyl ethylenedia mine,简称TEME
24、D) TEMED催化过AP产生自由基:,光聚合:催化剂是核黄素(ribofavin,即vita min B2,C17H20O6N4),核黄素在光照下能够产生自由基,催化聚合反应。一般光照23小时即可完成聚合反应。,聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制,丙烯酰胺的浓度可以在330之间。 低浓度的凝胶具有较大的孔径,如3的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用,可用于平板等电聚焦或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶,也可以用于分离DNA; 高浓度凝胶具有较小的孔径,对蛋白质有分子筛的作用,可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中,如1020的凝胶常用于SDS-聚丙
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