血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义.ppt
《血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义.ppt(174页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、,MicroRNAs in Renal Cell Carcinoma: Diagnostic Implications of Serum miR-1233 Levels 血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义 Lena M. Wulfken1Rudolf MoritzCarsten Ohlmann, Stefan HoldenriederVolker Jung, FrankEdwin HerrmannGisela Walgenbach-Bru nagelBeckerAlexander von RueckerStefan C. Mu ller,肾癌病理类型: 1透明细胞癌(clear cell
2、renal carcinoma) 为最常见的类型,占肾细胞癌的70%80%。 2乳头状癌(papillary carcinoma) 占肾细胞癌的10%15%。包括嗜碱性细胞和嗜酸性细胞两个类型。 3嫌色细胞癌(chromophobe renal carcinoma) 在肾细胞癌中约占5%。 肾癌的类型还包括集合管癌(collecting duct carcinoma)和肾癌未分类(renal cell carcinoma, unclassified)。,肾癌无论体积大小,约80%的患者早期可无任何症状,只是在普查和因其他原因作体格检查或B超检查时才被发现其肾脏有占位病变或触摸到腹部包块。有些患
3、者肾脏原发癌灶很小,无泌尿系或肾内症状,却首先表现出远处转移癌的症状。如发现患者腋下、腹部肿块,为找原发病灶才发现为肾癌。所以及时的了解肾癌症状是非常重要的。 但是目前还未发现用于诊断肾癌的血清标志物。,已有研究发现在癌细胞中微小RNA表达水平发 生了改变,因此微小RNA有可能作为癌症患者的诊断或预后的标志物,我们的研究旨在分析肾细胞癌患者循环血清中微小RNA的水平变化。,miRNA是一类长约 1924 nt的非编码单链小RNA分子, 在动物中, 绝大多数miRNA可以通过与靶基因 3 UTR区互补结合, 抑制靶基因翻译成蛋白质, 进而在细胞、组织或个体水平上影响生物体的生长发育, 并参与多种
4、疾病过程。 已有研究证实正常组织和肿瘤组织中miRNA表达明显改变. miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达模式. 这些特点也使miRNA有可能成为肿瘤诊断的新的生物学标记和治疗药物作用的靶标。,Methods Objectives:迄今为止,还没有对肾癌患者循环中微小水平进行研究的报道。我们设计了用低密度芯片(TaqMan Low Density Array)技术检测并且用传统的 real-time PCR在一独立组中证实了最有趣的microRNAs,,Participants:我们收集了肾肿瘤患者的血清,包括肾细胞癌和良性肾肿瘤(大嗜酸粒细胞瘤oncocytoma, 血管肌脂肪瘤Angiom
5、yolipoma),选取了非恶性疾病的手术患者作为对照组,表,我们收集来自、三所大学泌尿外科至这些患者术前的血液样本。 从血液样本中分离出血清。 We also analyzed formalin-fixed, paraffin embedded tissue from six patients stored in the archival files of the Institut furPathologie at the,RNA isolation: 提取血清中 提取病理组织切片中的,Low Density Arrays: Quantitative Real-Time PCR:,Stati
6、stical methods: real-time PCR得出的数据用SDS software v2.4分析,microRNA 水平用RQ Manager v1.2.1计算出, 数据分析用DataAssist v2.0, 数据统计用SPSS17.软件, microRNA 水平的特异性、灵敏性用分析,,Results Phase-1: 标志物的发现,载样缓冲液作用: 1)增大样品密度,以确保DNA均匀进入样品孔内 为了使样品能沉入胶孔,需加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重 2)使样品呈现颜色,从而使加样操作更为便利 3)含有指示剂,在电场中能以可预知速率向阳极泳动,指示剂,电泳过程中,
7、常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种: 溴酚蓝(bromophenol blue Bb) 呈蓝紫色, 二甲苯青蓝(xylene cyanol,Xc) 呈蓝色。 0.5TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长300bp的双链DNA相同,二甲苯氰(蓝)则与4kbp的DNA相同。所以根据分离样品中DNA分子的大小,可以参照指示剂Bb和Xc的迁移情况决定是否停止电泳,3 琼脂糖( Agarose)凝胶的制备,制好的凝胶,水平电泳槽,A 通常将溴化乙锭EB (0.5微克毫升,母液10mg/ml))渗人到凝胶和电泳缓冲液中。 B 也可使凝胶在不加溴化乙锭时进行电泳, 电泳结
8、束后再柒DNA。在室温下将凝胶浸埋在含溴化乙锭 (0.5微克毫升)的电泳缓冲液或水中45分钟。 C 而其他系列染色剂,例如SYBR Green,GelRed,虽然毒性小,但价格昂贵。,4、 琼脂糖凝胶中DNA的染色,溴化乙锭( Ethidium bromide, EB)染色,EB嵌入DNA碱基对之间, 会被紫外光激发而放出约600nm的荧光., EB为致癌物,操作时务必戴上手套!,SYBR-Green 染色,SYBR-Green灵敏度比EB高25100倍 SYBR-Green:荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中SYBR-Green的不会发射任何荧光信号 SYBR-Gr
9、een:广泛用于检测琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的RNA或单链DNA。,SYBR-Green I,5、加样,6、凝胶成像,1) 以紫外光做为光源.,2)需使用红或黄色滤光片去除光源干扰.,3)操作时须小心EB, 务必戴上手套.,估计DNA分子量,1353,1078,872,603,310,281/271,234,194,118,72,0,1,2,3,4,5,6,M,1,2,2,1,DNA粗略定量,20kb,12kb,10kb,6kb,1.2kb,0.8kb,1.将准确称量的粉状琼脂糖加人已定量的电泳缓冲液中; 2.在沸水浴中或微波炉中将糊状物加热直至琼脂糖完全溶解; 3.将溶液冷却至50-60 o
10、C,再加入溴化乙锭 (取自贮存在4 oC避光瓶中500毫克毫升水中的母液)至终浓度为0.5微克毫升; 5.将琼脂糖溶液灌注入制胶模具中,并立即插入梳子,使其齿在靠近胶一端的位置形成加样的孔格。 6.当凝胶完全凝固后(在室温下30一45分钟),小心取出梳子,将胶安放在电泳槽中; 7.加恰好足量的电泳缓冲液(若需要可加0.5微克毫升的溴化乙锭,使胶埋在溶液中深约l毫米处。,8 .加样 样品与载样缓冲液混合后,加样品到已浸埋在缓冲液中的凝胶孔格中。 载样缓冲液:通常制成6倍的浓缩液,与样品混合后,用微量移液器加样。 9 .电泳 电压:5v/cm,DNA向正极泳动直至溴酚蓝和二甲苯青蓝在凝胶中迁移出适
11、当的距离。 10 .检测 紫外灯,凝胶成像系统。防止EB污染!,六、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE),1、概述 1)支持介质:聚丙烯酰胺凝胶 单体:丙烯酰胺单体(acrylamide,Acr) 交联剂:N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylane bisacrylamide,Bis) 单体与交联剂在催化剂作用下聚合为凝胶 是目前生化实验室最常用的支持介质,CH2=CH,C=O,NH2,CH2=CH,C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH,-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH2 NH C
12、H2 NH C=O -CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH2 NH2,丙烯酰胺(Acr),N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis),聚丙烯酰胺,2、聚丙烯酰胺凝胶电泳分类,1) 根据凝胶系统的均匀性,可分为连续性和不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 连续性:整个电泳系统中所用的凝胶网孔、缓冲液及pH都是相同的,电泳时沿电泳方向的电势梯度均匀分布,简单易行; 不连续性:系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径,电泳过程中形成的电势梯度不均匀,能将较稀的样品浓缩成密集的区带,从而提高分辨率。,2)根据凝胶溶液和电泳缓冲液对样品构象的影响,可分为变性电泳和非变性电泳两类。
13、非变性:用于双链DNA片段的分离和纯化、有功能蛋白的分离与纯化。,变性:凝胶在尿素等抑制核酸碱基配对的试剂或蛋白变性剂SDS(如SDS-PAGE电泳)的存在下发生聚合。用途包括单链DNA的分离,如放射性DNA探针的分离、DNA测序反应产物的分析。 SDS-PAGE用于蛋白质分子量的测定。,3)根据在样品缓冲系统中是否加入还原剂-巯基乙醇或二硫苏糖醇,可将聚丙烯酰胺凝胶电泳分为还原电泳和非还原电泳。在前者中蛋白质的二硫键将被破坏,而在后者中则可以保留。如果蛋白质的二聚体或寡聚体是由链间二硫键来维系的,那么用该系统还可以区分目的蛋白的亚基聚合形式。,4)根据凝胶形状的不同还可以将聚丙烯酰胺凝胶电泳
14、分为圆盘电泳和平板电泳。前者指在圆形玻璃管内制胶,电泳后形成的区带为圆盘状;而后者是指凝胶的形状为平板状,有水平和垂直两种。平板电泳可同时进行多个样品的比较,而且还可作双相电泳,分辨率更高。,3、聚丙烯酰胺凝胶较之琼脂糖凝胶有如下优点,(1)在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好 (2)分辨率极高,可分开长度仅相差0.1的DNA分子,即1000bp中相差1bp (3)比琼脂糖凝胶的载样量大,在1cm 1mm的胶孔中能上样到10g的DNA样品,而分辨率并无明显下降 (4)回收的DNA样品纯度极高,可用于要求非常严格的实验,如转基因动物实验,引物合成后的分离纯化 (5)经常被用作分离蛋白质,且
15、分离效果好。,4、PAGE 的 聚 合,需要催化剂氧化还原系统作用,使Acr单体带有游离基,从而与Bis进行聚合。,(1)化学聚合:AP-TEMED系统,过硫酸胺(NH4)2S2O8(Ammonium persulfate,AP)作为催化剂,四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。,AP在水溶液中能产生游离基SO42-,使丙烯酰胺单体的双键打开,活化形成自由基丙烯酰胺,然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42- 。 注意: TEMED量多少都会影响催化作用,须在碱性条件下聚合 分子氧存在,聚合不完全,须去除分子氧,隔绝氧 升高温度能提高聚合,降低温度
16、能延迟聚合,(2)光聚合:核黄素-TEMED系统,核黄素(riboflavin)在光照下(可见光或紫外光)分解,其黄素部分被还原成无色型,但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素,其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意: 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合,凝胶的孔径受光照强度与时间的影响,导致孔径大小不同,从而影响蛋白质的分离。,聚合影响因素,大气氧能淬灭自由基,阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前,一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面,往往覆盖一层水或溶液,隔绝空气,可加速聚合。 低温、低pH都会减慢聚合反应速度。 有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃,一些
17、金属等可抑制聚合反应。,凝胶的物理性质如筛孔大小、机械强度、弹性、透明度都取决于凝胶总浓度(T)和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度(T)和交联度(C)的计算公式分别为:,5、PAGE的浓度与孔径的关系,Acr/Bis: 2040 完全透明且有弹性; 10 很脆,易碎,不透明; 100 糊状不成形,易破碎。,要制备透明而有弹性的凝胶, Acr/Bis要控制在30左右。 T在25时, Acr/Bis 20左右; T在510时, Acr/Bis 40左右; T在1520时, Acr/Bis =125200左右。 T在325的范围内,凝胶易发生聚合。,标准胶:在总浓度为7.5% 的凝胶中,大多数生物
18、体内的蛋白质能得到满意的分离效果。 对于一个未知样品,常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试,而后选出适宜的凝胶浓度。,6、分离效应,其分离效应包括: 浓缩效应(不连续系统中) 电荷效应 分子筛效应,不连续垂直柱状聚丙 烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应,系统的不连续性表现在以下方面: 1)凝胶由上、下两层凝胶组成 上层为大孔径的浓缩胶 下层为小孔径的分离胶 2)缓冲液离子组成、各层凝胶的pH不同 电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液 浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液 分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3)在电场中形成不连续的电位梯度,(1)凝胶孔径不连续性
19、: 在电场作用下,颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小,移动速度快;当进入小孔胶时,颗粒泳动受到的阻力大,移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处,由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带,HCl在溶液中解离出Cl-,在电场中迁移率快前导离子或快离子。 甘氨酸在pH8.3的电极缓冲液解离出NH2CH2COO-,在电场中迁移率很慢尾随离子或慢离子。 电泳开始时,在电流的作用下,浓缩胶中Cl-有效泳动率超过蛋白质,很快泳动到最前面,蛋白质紧随于其后,而NH2CH2COO-在最后面。,(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 :,快离子向前移动,而在快离子原来停留的那部分区域则形成了低离子浓度区,
20、即低导区。 低导区有较高的电势梯度,迫使蛋白质离子与慢离子在此区域加速前进。由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间,因此也就聚集在这个移动的界面附近,被浓缩形成一个狭小的中间层.,低导区,电荷效应,当样品进入分离胶后,由于每种蛋白质所带的电荷多少不同,因而迁移率也不同。电荷多的,分子小的泳动速度快,反之,则慢。于是,各种蛋白质在凝胶中得以分离。,分子筛效应,分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率,此即分子筛效应。 颗粒小,形状为圆球形的样品分子,通过凝胶孔洞时受到的阻力小,移动较快;反之,颗粒大,形状不规则的样品分子,通过凝胶的阻
21、力较大,移动慢。,制胶玻璃板,SDS(十二万及磺酸钠)是阴离子表面活性剂,与蛋白质结合形成SDS-蛋白复合物,蛋白质分子即带大量的负电荷,并远远超过原来所带的电荷,使天然蛋白质分子之间的电荷差别降低,甚至可以忽略 同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散,形状趋向一致,因此,排除了蛋白质的电荷和结构差异,SDS-蛋白质复合物在电泳时的泳动差异就由蛋白质的分子量所决定。,(电荷效应),7、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE),蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变,SDS-PAGE主要用途: 分离蛋白质 蛋白亚基分子质量的测定,SDS-PAGE 电泳过程 (一)试剂配置 1、3
22、0%丙烯酰胺混合液(Acr:Bis 为29:1):称取丙烯酰胺(Acr)29g及甲叉丙烯酰胺(Bis)1g,用水溶解并稀释至100ml,贮棕色瓶中于4保存,可用一个月。 ( Acr和Bis有神经毒性!) 2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液:取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷(Tris)36.6g,加水至80ml使其溶解,调pH至8.8,然后用水稀释至100ml,置棕色瓶中,4贮存。,3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液:取1mol/L HCL溶液48ml,Tris5.98g,加水至80ml,调pH6.8,用水稀释至100ml,置棕色瓶中,4贮
23、存。 4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:称取Tris 6g、甘氨酸28.8g,加水850ml,调pH至8.3,加水到1000ml,4贮存。用时可做10倍稀释。 5、10% 过硫酸铵(AP) 6、10%SDS(十二烷基磺酸钠) 称取 SDS 10g,加水100ml使其溶解。(戴好口罩),7、四甲基乙二胺(TEMED) 8、上样缓冲液:取1.0mol/L pH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml,蔗糖10g,SDS 2.3g,1g/L溴酚蓝10ml,加蒸馏水溶解,混合至100ml。 9、考马斯亮蓝染色试剂 考马斯亮蓝R250染色液:浓度为2.5g/L,用甲醇醋酸蒸馏水=515的溶液配制(V/V)
24、。 10、脱色液:取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml,加蒸馏水至100ml。 11、样品,(二)灌胶 1、先将胶板(590mm)封好,将配制好的分离胶液按配方灌注入胶板内,约70mm高度(掌握分离胶的高度),在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液(约34mm)。用于隔绝空气,使胶面平整。室温下静置约3060min。观察胶和正丁醇之间的界面,判断胶是否凝固。要在确认分离胶彻底凝固后才开始配制浓缩胶。,2、分离胶凝固好后,倒掉覆盖在分离胶表面的正丁醇,并用去离子水冲洗一次,倒置吸净残留的水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶板内(约15mm),插入合适的梳齿,室温下静置约3060min。观察胶界面,判断胶是否凝固,准备
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 血清 miR 1233 细胞 诊断 意义
链接地址:https://www.31doc.com/p-3536712.html