DNA体外重组技术-唐旭东-2013级-jian.ppt
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1、第五章,基因工程基本技术,概述,一、DNA重组技术相关概念,克隆(clone) 来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物(常被成为副本或拷贝)。,克隆化(cloning) 获取大量单一拷贝的过程,也称无性繁殖。,DNA克隆(DNA cloning),应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子(复制子)-重组DNA 。 继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞。 再进行扩增提取获得大量同一DNA分子的过程称为DNA克隆,又称为基因克隆(gene cloning)或分子克隆(molecular cloning)。,
2、“克隆”某一基因或DNA片段过程中,将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合DNA,所以DNA克隆又称重组DNA (recombinant DNA)。,实现DNA克隆所用的方法及相关的工作称DNA重组技术(recombinant DNA technology),又称基因工程(genetic engineering)。,基因工程目的: 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质),二、DNA重组技术基本程序,外源DNA的获取,连接物(重组DNA)导入合适受体细胞,目的基因与载体的连接,克隆载体的选择与构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,分、切、接、转、筛,(一
3、)按功能分类,(二)按受体细胞分类,(三)按载体来源分类,一、载体的分类,细菌培养,质粒扩增并表达蛋白质,大肠杆菌,染色质,质粒,定义: 是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子,是能赋予细菌某些特性的辅助性遗传单位。,二、不同载体的特点与分类 (一)质粒载体 1. 质粒(plasmid)的特征,1. 质粒的特征,功能: 使宿主细胞具有抵抗不利自身生长因素的能力。 性质:具有不相容性 按拷贝数分类: 严谨性(低拷贝) 松弛型(高拷贝),克隆用质粒载体应具备的特点:,分子相对较小,具有较高的拷贝数 含高效的复制子,可用氯霉素阻止细菌蛋白质的合成,使质粒的拷贝数增加。 具有多种遗传选
4、择标记,包括各种抗药基因或营养代谢基因等。,2. 质粒载体的分类: 克隆载体和表达载体 (1)克隆用质粒,抗药基因或营养代谢基因,氨苄青霉素抗性基因(ampr):编码-内酰胺酶,水解amp -内酰胺环使amp失效 四环素抗性基因(tetr):编码转膜泵将tet从细胞移出 大肠杆菌LacZ基因:编码半乳糖苷酶,分解X-gal,使菌落变为蓝色。,*lac Z N端146 aa残基编码基因 *lac Z编码产物为半乳糖苷酶片段(N端),突变型lac E. coli可表达该酶的片段(C端),两片段单独存在无活性 *两端同时存在时有活性-蓝色化合物 互补( complementation) *在Lac
5、Z 基因内无外源DNA的插入,在含X-gal的培养基上生长时会出现蓝色菌落-阴性克隆。 *在Lac Z 基因内插入外源DNA,在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落-阳性克隆。,X-gal,蓝色化合物,-半乳糖苷酶,Lac-Z基因,互补筛选-蓝白斑筛选,外源DNA插入,白色,IPTG诱导,异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为半乳糖的类似物,互补筛选法-(237),阴性克隆,阳性克隆,Ampr,ORI,Tetr,pBR322质粒:一种克隆质粒,ORI:复制起始点, 保证高拷贝自我复制。,结构:,Ampr, Tetr:,两个抗性基因用于 筛选阳性克隆。,Pst I, BamH I:,两个单
6、酶切位点用于插入目的基因,Ampr,LacZ,MCS,pfxBlue: 克隆质粒,MCS:Multiple Cloning Site,提供多个单酶切位点用于克隆操作,LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆,pUC18/pUC19,*pUC18/pUC19的MCS方向相反,pMD-18 T simple克隆载体的结构,2. 质粒载体的分类:,(2)表达用质粒载体: 除具备载体的必备条件外还应有用于外源基因表达的元件:如启动子、终止子等 分类: 原核表达载体 真核表达载体,pET-32a(+)原核表达载体的结构,*pET系列的基本结构: T7启动子、MCS、T7终止子、Ampr等,*可将T7 RNA聚合酶
7、基因置于lac启动子的控制下,pcDNA3:真核细胞表达质粒,Pcmv:,CMV增强子/启动子,驱动目的基因在真核细胞内表达,BGH pA:加尾信号,目的基因转录后加上polyA尾,使其更稳定。,(二) 噬菌体,A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR,重组区,cos末端,cos 末端,A,R,A,R,EcoRI,目的基因,EcoRI,EcoRI,插入型,置换型,噬菌体作为载体具有两个特点, 噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上,噬菌体基因组中央含有30%的DNA是噬菌体生长所非必需的。, 噬菌体的成熟需要包装,当与外源DNA重组后的大小介于原来的75
8、%105%之间时,重组的DNA分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。,噬菌体的种类:,Charon系列、 gt系列、EMBL系列,(三)粘粒载体(cosmid),质粒序列:复制原点,抗性标志 噬菌体:cos粘端序列 插入片段长度可以是载体本身长度的7-10倍,(四) 酵母人工染色体载体(YAC),质粒pBR322衍生物,酵母基染色体,中心粒,端粒,复制起点顺序,复制起点(ori),Ampr基因,组成,用途,构建真核生物基因组DNA文库,能携带更大(1Mb)的插入片段,第二节,基因工程中常用的工具酶,一、限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease,RE),是能够识别和切割双链
9、DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。,+,Bam H,定义:,切基因工程的手术刀,、(基因工程技术中常用型) 切基因工程的手术刀,分类:,一、限制性核酸内切酶,命名:,Hin d,Haemophilus influenza d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 识别顺序一般为46个碱基,通常为回文结构(palindrome) (核苷酸序列呈二元旋转对称,180反向重复),切口 :平端切口、粘端切口,Bam H,Hind,+,平端切口,粘端切口,平头或钝性末端(blunt end),粘性末端 (sticky end),产生5 突出黏性末端 (sticky end),EcoR I,
10、产生3 突出黏性末端,Pst I,酶单位定义:,在适当反应条件下,1h内在50l体系中完全酶解1g特定DNA底物所需酶量,定为1个活性单位。,出售的内切酶几乎均以噬菌体DNA作底物测其酶活性单位。,酶切鉴定 :琼脂糖凝胶电泳,二、DNA聚合酶,含3种酶活性:,1. 大肠杆菌DNA聚合酶I,5 3聚合酶活性 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性,催化DNA缺口平移反应,制备DNA探针(5 3外切酶活性)-主要用途 DNA序列分析,应用:,二、DNA聚合酶,2. Klenow片段,随机引物标记法标记探针-主要用途 双脱氧末端终止法进行DNA测序 cDNA第二链的合成 DNA 3突出末端进行末端标记,
11、用途:,(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段, 缺5 3外切酶活性) #38.,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸, 5核酸外切酶活性 DNA聚合酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA,进行分子生物学研究中常用的工具酶。,二、DNA聚合酶,PCR反应-主要用途 DNA测序,用途:,3. Taq DNA聚合酶(65kD),耐热, 在7075时具有最佳的生物活性, 无3 5外切酶活性(无校正功能) #40.,35外切酶活性的功能,校读(proofread)功能,17/62,将错配的核苷酸从引物链的3端除去,(1)反
12、转录活性:即以RNA为模板合成DNA(主),(2)RNase H活性:水解RNA-DNA中的杂合 分子中的RNA,(3)DNA-pol活性:以DNA为模板合成DNA,4. 反转录酶(Reverse Transcriptase, RT),二、DNA聚合酶,反转录病毒细胞内的逆转录过程,RNase H活性,单链DNA,三、DNA连接酶(DNA ligase) 基因工程的缝纫针,*催化双链DNA相邻碱基5-P和3-OH间磷酸二酯键形成的酶。,*T4噬菌体DNA连接酶-最常用,催化两个独立DNA片段(粘性末端和平末端) 5-P和3-OH之间形成磷酸二酯键。,*主要功能与用途:,催化平末端连接要比粘性末
13、端 效率低得多。,修复双链DNA分子中单链缺口。,四、其他修饰酶,功能:,催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DNA分子的3-OH末端。,(一) 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),用途:,1. 主要作用是在载体或目的基因 3末端加上同源多聚尾巴,形成人工粘性末端,便于DNA重组。,2. DNA 3末端的同位素标记。,催化DNA、RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的 5 磷酸基团水解。,用途:,1. 在连接反应中去除载体DNA片段5-P,防止载体自我连接.,2. 用32P标记5末端时,用此酶去除5-P,再用激酶进行5的 32P标记.,(二) 碱性磷酸酶,功能:,(三) 多聚核苷酸激酶 (四) RNa
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