PCSK9+siRNA经线粒体途径抑制oxLDL诱导的HUVECs凋亡.pdf
《PCSK9+siRNA经线粒体途径抑制oxLDL诱导的HUVECs凋亡.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《PCSK9+siRNA经线粒体途径抑制oxLDL诱导的HUVECs凋亡.pdf(57页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、 4 中文摘要 研究背景 内膜损伤是动脉粥样硬化 (Atherosclerosis, As) 的始发环节。 研究表明 oxLDL 引起平滑肌细胞凋亡,可能与上调 P53 和下调 Bcl-2 的表达有关。另一些研究已 证实 oxLDL 与细胞膜表面的受体 LOX-1 结合引起内皮细胞的凋亡,主要经下调 Bcl-2 的蛋白表达,线粒体依赖性凋亡信号通路。 PCSK9 作为一种神经细胞凋亡调节转化酶,参与肝脏的再生,调节神经细胞 的凋亡,脂质代谢等多种作用。通过降低肝细胞上 LDLR 的数量,影响 LDL 的内 化,使血液中 LDL 不能清除,从而导致高胆固醇血症。高胆固醇血症是一个已被 确认的动脉
2、粥样硬化的独立危险因素。 另有研究证实 PCSK9 在胚胎发育中具有促 进神经细胞分化的作用,体外细胞实验发现其可参与神经细胞的凋亡,在此过程 中有凋亡调节因子 Caspase3 和死亡受体 6 的共同调节。 本课题组的前期研究表明: PCSK9 siRNA 能明显抑制 oxLDL 诱导的 THP-1 源性巨噬细胞的凋亡,但其机制 不清。PCSK9 siRNA 是否对血管内皮细胞的凋亡也有影响还未见报道。 目的 本研究为了检测 oxLDL 诱导的 HUVECs 凋亡中 PCSK9 的表达变化;PCSK9 siRNA 是否抑制 oxLDL 诱导的 HUVECs 凋亡及探讨其机制。 材料与方法 用
3、不同浓度的 oxLDL 处理 HUVECs 24h,Hoechst33258 染色检测细胞凋亡, RT-PCR、 western blot 分别检测 PCSK9 mRNA、 LOX-1 mRNA 和 NARC-1、 LOX-1 蛋白的表达。应用 Lipofectamine2000 转染不同浓度的 PCSK9 siRNA 进入 HUVECs,筛选出最有效的 siRNA 浓度转染 HUVECs 24 h 后,再加入 oxLDL 处 理 24 h,Hoechst33258 染色观察评价细胞凋亡,western blot 检测凋亡相关蛋白 Bcl-2, Bax 及 Caspase3, -8, -9 的
4、表达, 酶标法检测 Caspase3 和 Caspase9 的活性, Hoechst33258 染色观察形态评价细胞凋亡和流式细胞计数凋亡率。 结果 随着 oxLDL 浓度的不断增加,HUVECs 凋亡率逐渐增加,以 80g/ml oxLDL 处理 24h 后,Hoechst33258 染色可见大量凋亡细胞。同时 RT-PCR、western blot 5 检测发现 LOX-1 和 NARC-1mRNA,蛋白表达均增高。不同浓度的 PCSK9 siRNA 转染 HUVECs 后,RT-PCR 和 western blot 筛选出 siRNA 终浓度,作用细胞 24 h 后,再用 oxLDL 处
5、理 24 h,Hoechst33258 染色和流式细胞术检测 oxLDL 处理组 细胞凋亡率明显增加,转染 PCSK9 siRNA 组细胞凋亡率明显减少。而 RT-PCR 和 western blot 检测结果表明 LOX-1 的蛋白和 mRNA 表达在转染 PCSK9 siRNA 组和 oxLDL 组无明显差异。Western blot 检测结果发现 PCSK9 siRNA 能明显下调 Bax 蛋白的表达和上调 Bcl-2 蛋白的表达,同时观察转染 80nmol/L PCSK9 siRNA 后用 oxLDL 处理细胞 24 小时其对 Caspase3, Caspase8 和 Caspase9
6、 的影响, western blot 结果显示 Caspase3,Caspase9 的蛋白表达明显上调,而对 Caspase8 的蛋白表达无 影响。酶标法检测 Caspase3,Caspase9 的活性均降低。 结论 1.OxLDL 能上调 PCSK9 mRNA 和蛋白质的表达,而 PCSK9 siRNA 能有效抑制 PCSK9 基因的表达,从而抑制由 oxLDL 诱导的 HUVECs 凋亡。 2.PCSK9 siRNA 抑制 HUVECs 的凋亡主要经 Bcl/Bax-Cyt C-Caspase 9-Caspase3 线 粒体凋亡通路。 关键词 前蛋白转化酶枯草溶菌素 9/神经细胞凋亡调节转
7、化酶-1;小分子干扰 RNA;人脐 静脉内皮细胞;凋亡;氧化型低密度脂蛋白;Caspase 通路 6 PCSK9 siRNA inhibits HUVECs apoptosis induced by oxLDL via mitochondrial pathway Abstract Background Endothelial injury is an initiating factor of atherosclerogenesis. Endothelial cells apoptosis is easier than necrosis leading to the occurrence of
8、atherosclerosis. Studies have shown that smooth muscle cell apoptosis induced by oxLDL may be related to upregulate the expression of P53 and downregulate the expression of Bcl-2. Other studies have confirmed that oxLDL can bind LOX-1 receptor, reduce the expression of Bcl-2 and can inhibit apoptosi
9、s induced by a mitochondrial-dependent apoptotic signaling pathway. PCSK9 as a neural apoptosis-regulated convertase 1, plays an important role in liver regeneration, the differentiation of cortical neurons and lipid metabolism, and other multiple roles by impacts the level of low density lipoprotei
10、n receptor (LDLR) in liver.However, excessive accumulation of intracellular LDL affects the clearance of plasma LDL,then resulting in hypercholesterolemia.It has been confirmed that hypercholesterolemia is an independent atherosclerotic risk factor. Scientists have discovered that PCSK9 facilitated
11、the neuronal differentiation in the process of embryonic development, and found to participate in the apoptosis of nerve cells in vitro, apoptotic regulatory factors Caspase3 and co-regulated death receptor 6 may be regulate this process. Our research have showed that PCSK9 siRNA inhibited oxLDL ind
12、uced THP-1 derived-macrophage apoptosis, but the mechanism is unclear. Whether PCSK9 siRNA also impact apoptosis of endothelial cells have not been reported. Objective In order to examine the effect of oxLDL on PCSK9/NARC-1 expression in HUVECs, and examine the role of PCSK9 siRNA on oxLDL induced a
13、poptosis of HUVECs and the expression of apoptotic-related proteins. 7 Materials and Methods HUVECs were incubated with diffenrent concentration of oxLDL for 24h.The apoptosis of HUVECs was observed by staining with Hoechst33258; RT-PCR、western blot were conducted to detect the expression of PCSK9、L
14、OX-1 mRNAs and proteins respectively. The PCSK9 siRNAs gene were transfected into HUVECs by positive ion liposome Lipofectamine 2000. Transfection efficiency was assessed by fluorescence microscope assay. The most efficient siRNA was selected to transfected into HUVECs,after transfection for 24 h, c
15、ells were treated with oxLDL for 24 h, the rate of HUVECs apoptosis transfected siRNA was detected by staining with Hoechst 33258 and flow cytometer. Western blot was conducted to detect the expression of apototic proteins Bcl-2,Bax,Caspase3,8,9 expressions. The activity of Caspase3,9 was detected b
16、y Enzyme linked immunosorbent assay. Results The results showed that a number of cells with nuclear condensation induced by 80g/ml oxLDL for 24h increased significantly,Hoechst33258 staining showed a number of cells apoptosis. PCSK9 was upregulated with increasing concentration of oxLDL in HUVECs, w
17、hile 80g/ml oxLDL increased significantly. Moreover,RT-PCR、 western blot showed that LOX-1,PCSK9 mRNAs and proteins both increased.The different concentration of PCSK9 siRNAs were transfected into HUVECs,the most effective dose of siRNA was selected by RT-PCR and western blot.HUVECs pretreated with
18、PCSK9 siRNA for 24h , then cells treated with oxLDL for 24h, oxLDL-induced apoptosis was significantly reduced in HUVECs transfected with siRNA detected by staining with Hoechst33258 and flow cytometer. PCSK9 siRNA upregulated Bcl-2 protein expression while Bax expression was decreased. Compared wit
19、h control,PCSK9 siRNA supressed Caspase3,9 proteins expression,but had on effect on Caspase8. Moreover,activity of Caspase 3,9 both decreased by PCSK9 siRNA.Apopotosis of HUVECs decreased significantly by PCSK9 siRNA,but the expression of LOX-1 between siRNA and oxLDL treatment had no difference. 8
20、Conclusions 1.These results revealed that the expression of PCSK9 mRNA and protein were increased by oxLDL. PCSK9 gene expression could be effectively suppressed by siRNA. So oxLDL induced apoptosis of HUVECs could be effectively suppressed by PCSK9 siRNA. 2.Our study demostrated that PCSK9 siRNA in
21、hibits HUVECs apoptosis via Bcl/Bax-Cyt C-Caspase 9-Caspase3 mitochondrial pathway. Postgraduate: Chunyan Wu(Pathology and Pathophysiology) Directed by Supervisor: Prof. Lushan Liu KEY WORDS PCSK9;siRNA;HUVECs;apoptosis;oxLDL; Caspase pathway 9 前言前言 正常血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)在血液和血管壁内膜之间起着重要 的屏障
22、作用,同时分泌各种生物活性物质调节血管张力和血管渗透性,防止血栓 形成,抑制炎症反应等。内皮细胞增殖和凋亡的动态平衡维持内皮细胞正常功能, 目前许多研究表明细胞凋亡是动脉粥样硬化发生的重要因素。在各种刺激因子的 诱导下人类血管内皮、平滑肌和心肌细胞发生凋亡是多种心血管病发生与演变的 细胞学基础。大量实验证实内皮细胞的过度凋亡是引起内皮功能障碍的一个重要 因素,可诱发As的发生1,主要表现为:内皮凋亡失去抗凝固的膜成分,使细胞 表面的磷脂酰丝氨酸暴露,起到促凝的作用,与血栓形成有关2;细胞凋亡与血 管重构有关,易发生As的局部血管内皮细胞出现更新增加的现象,在As斑块的形 成和发展中起重要作用3
23、。此外,细胞凋亡与粥样斑块的稳定性有关,斑块处细 胞凋亡显著增多,特别是出现在纤维帽深层的中膜肩部,这对斑块的稳定非常不 利,易造成斑块的破裂4。 实验证明氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)、活性 氧 (reactive oxygen species,ROS)、血管紧张素(Ang)等均能诱导内皮细胞凋亡,同 时被证实是动脉粥样硬化的诱发因素5; Hessler早在1979年就发现oxLDL对内皮细 胞有毒性作用,可直接损伤内皮细胞,毒性剂量的oxLDL能诱发培养的内皮细胞 出现大批凋亡。近年来随着对细胞凋亡检测手段的日益完善已明确
24、oxLDL诱导内 皮细胞凋亡是动脉粥样硬化发生的始动环节7,8。Holvoet P等9在冠脉造影的病人 中发现,有冠状动脉病变的患者血浆oxLDL水平是未发现病变的对照组人群的2 倍;Yasunobu等10在遗传性高血脂家兔和人血浆中发现了能特异性识别oxLDL表 位的抗体,血液中该抗体的含量与冠状动脉再狭窄密切相关。目前的研究资料表 明oxLDL参与了动脉粥样硬化发生、发展的各个环节,oxLDL能引起体外内皮细 胞的凋亡,从而促进动脉粥样硬化的进展,其在动脉粥样硬化中的地位和作用日 益受到重视。 PCSK9 作为一种神经细胞凋亡调节转化酶,编码一种新的丝氨酸蛋白酶,表 达于肝脏,神经组织,肾
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- PCSK9 siRNA 经线 途径 抑制 oxLDL 诱导 HUVECs
链接地址:https://www.31doc.com/p-3579848.html