产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵、酶的分离纯化及性质的研究.pdf
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1、产H 醢软骨素酶菌株的筛琏,筮酵酶的分离纯化及性质的研究 产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵、酶的分离纯化 及性质的研究 摘要 硫酸软骨素酶在研究硫酸软骨索类糖胺多糖的结构、性质与功能等方面有多 种重要用途。近年来,浚酶在晦床领域的应用广泛,用来治疗某些疾病如大肯节 病、椎间盘突出等。同时,该酶在制备低分子量硫酸软骨素方面也存在着广阔的 应用前景。因此,获得酶活力高的硫酸软骨素酶具有重要的挫沦和现实意义。本 研究从微生物中筛选出一株高产硫酸软骨素酶的菌株并对菌株的发酵培养条 件、酶的分离纯化及酶学性质等做了系统的研究。 通过初筛和复筛从采集的样品中获得了一株高产硫酸软骨紊酶菌株,编号为 2 8 对
2、其形态和生理生化特性进行了测定,初步鉴定该菌株为少动鞘氢醇单胞菌 ( 曲h i n g o m o n a s p a u c i m o b i l i s ) 。该菌株所产的硫酸软骨素酶为胞外酶。 为了提高产酶菌株的产酶能力,采用单次单因素实验方法对其进行了发酵产 酶条件的优化。得到的最适发酵培养基组成为( ,w v ) :酵母粉10 + 硫酸软目 素0 5 + N a C l05 + K H 2 P 0 40 , 0 3 + M g S 0 47 H 2O0 5 ,起始p H 85 :最适发酵培养条件 为:摇瓶培养10 接种量、2 5 0 m L 摇瓶装量4 0 m L 、2 5 “ (
3、 2 、1 0 0 r m i n 振荡培养3 6 h , 酶括力可达】2 U m L 。 硫酸软骨素酶的分离纯化,采用了( N 儿) 2 s 0 4 沉淀、D E A E S e p h a r o s eF a s t F l o w 阴离子交换层析及S e p h a d e xG 10 0 凝胶过滤层析等纯化步骤,结果获得了 电泳纯的硫酸软骨素酶,酶纯化倍数为1 5 56 2 ,酶收率为4 68 7 ,比活力为 9 80 4 U m g 。经S D S - P A G E 电泳呈单条带分子量约为8 23 k D a 。 酶学性质的研究包括p H 、温度、金属离子、底物浓度和底物专一|
4、生等。结 果显示:该酶为诱导酶,在不添加硫酸软骨素的培养基中没有酶活性;该酶的最 适反应p H 值为65 ,最适反应温度为4 0 “ 0 ;在实验所涉及的金属离子中,大部 分金属离子对酶反应无影响:该酶对底物具有相对专一性,能降解硫酸软骨索、 透明质酸和肝素等这一类结构相似的硫酸软骨素类糖胺聚糖,而对甲壳素和壳聚 糖无降解作用。 对该硫酸软骨素酶的酶解产物进行了质谱分析结果显示该酶的降解产物几 F 硫酸软骨紊酶蒂株的筛选、发B 酶的讣离纯化& 性质的研究 乎全为二一糖, b 度较- 留,测得的降解产物的分子垦约为4 5 8 D a 。 关键词:硫酸软骨素酶;发酵条件优化,分离纯化:酶学性质 P
5、 醢酸软骨亲酶* # 的镕、发H 鸸分离化& 性质研究 S t u d yo nt h eS c r e e n i n g ,F e r m e n t a t i o no f C h S a s e P I o d u c i n g S t r a i n s ,a n dP u r i f i c a t i o na n dP r o p e r t i e so f t h eC h S a s e A b s t r a c t C h o n d r o i t i n a s eh a sav a r i e t yo fa p p l i c a t i o n si n
6、m a n yw a y s ,s u c ha s s t u d y i n gt h eg l y c o s a n l m O g l y c a n s s t r u c t u r e ,p r o p e r t i e sa n df u n c t i o n sa n d s oo nR e c e n ty e a r st h ea p p l i c a t i o no fC h S a s ei nt h ec l i n i c a lf i e l di s e x t e n s i v e ,c u r i n g s o m ed i s e a s
7、 e ss u c ha st h eK e s h i n B e c kd i s e a s e , i n t m w e r t e b r a ld i s cp r o t r u s i o na n ds oo nA tt h es a n l et i m e ,i ta l s oh a sa b r o a dr i s ei np r e p a r i n gl o wm o l e c u l a rw e i g h tc h o n d r o i t i ns u l f a t eS oi ti s o fi m p o r t a n tt h e o
8、r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c ef o rg e t t i n gC h S a s ew i t h h i g he n z y m ea c t i v i t yT h i ss t u d ys c r e e n e daC h S a s e - p r o d u c i n gs t r a i nw i t h h i g ha c t i v i t y ,a n dr e s e a r c h e dt h ef e r m e n t a t i o n ,p u r i f i
9、c a t i o n ,a n dp r o p e r t i e s o f t h eC h S a s e s y s t e m a t i c a l l y T h es t r a i nw i t hh i 曲C h S a s ea c t i v i t y , n u m b e r e d2 8 ,w a so b t a i n e d f r o mt h es o i ls p e c i m e nb ym e t h o d so f p r e l i m i n a r ya n ds e c o n ds c r e e n i n g I tw a
10、 si d e n t i f i e dt ob eS p h i n g o m o n o sp a u c i m o b i l i sa c c o r d i n gt o b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n db i o c h e m i c a l r e a c t i o nt e s t sT h eC h S a s e p r o d u c e db yt h es t r a i nw a se x t r a c e l l u l a r - e n z y m e I no r d e
11、rt o i m p r o v e t h eC h S a s e p r o d u c t i v i t y ,t h e f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sf o rC h S a s e p r o d u c t i o n w a s o p t i m i z e d u s i n g o n e f a c t o r a t a t i m e m e t h o d o l o g y T h e o p t i m a lc o m p o s i t i o n o f f e r m e n t a t i
12、o nm e d i u mw a sa s f o l l o w s ( ,w v ) :y e a s t e x t r a c t10 , 1 产硗酸轼骨素哺苗摊的筛选、发孵酶的井离纯化肚性质的研究 c h o n d r o i t i ns u l f a t e0 5 ,N a C l 05 ,K H 2 P 0 400 3 ,M g S 0 47 H 2 00 5 ,t h e i n i t i a lp H8 5A n dt h eo p t i m a lc u h i v a t i o nc o n d i t i o n sw e r es e a l e da
13、s :1 s e e dc u l t u r ew a st r a n s f e r r e dt oa4 0 r a Ls t e r i l i z e df e r m e n t a t i o nm e d i ai n 2 5 0 m Lc o t t o n p l u g g e df l a s k sa n di n c u b a t e da t2 5 f o r3 6 hw i t h r e c i p r o c a t i o n ( 10 0r m i n ) T h eC h S a s ea c t i v i t yc o u l dr e a c
14、 h 12 U m L w h e nt h es t r a i nw a si n c u b a t e du n d e rt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s T h eC h S a s ew a sp r e p a r e df r o mt h ef e r m e n t e db r o t hb ya m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ,D E A Es e p h a r o s e f a s tf l o w
15、 i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a ma n dg e lf i l t r i t i o nw i t hs e p h a d e xG 一1 0 0c h r o m a t o g r a mT h e p u r i f i e de n z y m em o v e da sas i n g l ee l e c t r o p h o r e t i cb a n di nS D S - P A G E a n dt h em o l e c u l e rw e i g h tw a sa b o u t8 23k D a
16、T h r o u g ht h ep u r i f i c a t i o n , t h eC h S a s ew a s p u r i f i e d1 5 56 2 一f o l do v e rc u l t u r es u p e r n a t a n ti n4 68 7 y i e l da n di t ss p e c i f i ca c t i v i t yw a sa b o u t9 80 4 U m g T h er e s u l t so f p r o p e r t i e so f t h eC h S a s ew e r ea sf o
17、l l o w sT h e e n z y m e w a sp r o v e dt ob ei n d u c i b l ee n z y m e ,a n dt h e r ew a sn oC h S a s ea c t i v i t yi n t h em e d i aw i t h o u tC h ST h eo p t i m a lp Ha n dt e m p e r a t u r ef o re n z y m e a c t i v i t yw a s6 5a n d4 0 Cr e s p e c t i v e l y M o s ti n o r g
18、 a n i cm e t a li o n sh a dn o e f f e c to nt h eC h S a s ea c t i v i t yT h es t u d yo ns u b s t r a t es p e c i f i c i t ys h o w e d t h a tt h e e n z y m ew a sr e l a t i v e l ys p e c i f i c i t y t os u b s t r a t e s ,w h e na c t i v e d e g r a d a t i o no c c u r r e do nc h
19、 o n d r o i t i ns u l f a t e ,h e p a r i na n dh y a l u r o n i ca v i d w h i c hw e r es i m i l a ri nt h es t r u c t u r e s ,w h i l ec h i t i na n dc h i t u s a nw e r en o t d e g r a d e db yt h ee n z y m e F # 骨i 酶菌株的筛选、牲醉,酶“ 离纯n H 厦的究 T h e p r o d u c t s o b t a i n e df r o mt
20、h ee n z y m ew a sa n a l y s e d b ym a s s s p e c t O l X l e t l Y T h ep r o d u c t sw a sd e t e r m i n e da su n s a t u r a t e dd i s a c c h a r i d e , a n dt h el e v e lo fu n s a t u r a t e dd i s a c c h a l i d er i s e d t o n e a l l y 10 0 T h e m o l e c u l a ro f t h eu n s
21、 a t u r a t e dd i s a c c h a r i d ew a sa b o u t4 5 8 D a K e yw o r d s :C h o n d r o i t i n a s e ;o p t i m i z a t i o n o ff e l i n e n t a t i o nc o n d i t i o n s ; e n z y m ep u r i f i c a t i o n ;e n z y m ep r o p e r t i e s P n # 女棒的筛选筮”、* 离纯化性“ R 目录 摘要 I A b s t r a c t 1 I
22、 I 第一章前言 1 l l 硫酸软骨素 1 1 l l 硫酸软骨素的结构及种类 1 1 j2 硫酸软骨素的性质 2 1 13 硫酸软骨素的生物活性 2 l14 硫酸软骨素的应用研究 3 12 低分子量硫酸软骨素 5 l3 硫酸软骨素酶 7 】3 】硫酸软骨素酶的种类 7 132 硫酸软骨素酶的分离纯化 9 l33 硫酸软骨素酶的药理作用 1 0 3 4 硫酸软骨素酶的应用研究 l4 本论文的研究目的与意义 l3 帮二章硫酸软骨索酶产生菌的筛选及菌种的鉴定 1 4 2 1 实验材料、试剂与仪器 1 4 2 l1 培养基 1 4 2 12 主要试剂 1 4 2 l3 主要仪器 1 4 22 实验
23、方法 1 5 221 菌株的初筛平板快速筛选法 15 2 22 菌株复筛 2 23 硫酸软骨素酶活力的测定 1 6 2 , 24 菌种鉴定 一1 6 2 3 实验结果 1 7 2 3 1 菌株初筛结果 2 , 32 菌株复筛结果 2 33 菌种的鉴定 1 7 1 7 2 , 4 小结 1 9 2 4 l 关于筛菌 一1 9 2 42 关于菌株鉴定 1 9 第三章产硫酸软骨素酶菌株发酵条件的研究 2 1 f “硫醴软骨寨酶菌睐的筛选、笸酵、酶分离业化性域的“ 究 3 l 实验材料、 3 1 1 菌种 试剂与仪器 2 3 12 培养基 3 13 主要试剂 3 14 土要仪器 32 实验方法 321
24、 硫酸软骨索酶活力的测定 3 22 菌体的生长曲线的测定2 2 323 发酵培养条件的研究 2 2 33 实验结果2 4 33 1 菌株的生长曲线 2 4 3 32 发酵产酶条件的研究 2 5 3 4 小结 2 9 第四章硫酸软骨索酶的分离纯化与酶学性质研究 3 0 4 1 实验材料、试剂与仪器 4 11 菌种3 0 4 I2 培养基3 0 4 l3 主要试剂3 0 4 I4 主要仪器3 1 42 实验方法 3 2 42 】硫酸软骨紊酶粗品的制各3 2 4 22 硫酸软骨素酶的纯化3 3 4 23 硫酸软骨素酶活力测定方法3 4 4 24 蛋白质含量的测定3 4 4 25 蛋白质的纯度鉴定及分
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