双酚A遗传毒性研究.pdf
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1、中文摘要中文摘要 双酚双酚 A遗传毒性研究遗传毒性研究 II 部分菌株的回变菌落数有所增加,但并无统计学差异。 结论:(1)外培养条件下,双酚 A 在染毒浓度为 40 mol/L 作用 12h 后,可显 著刺激细胞的生长, 表现出一定的刺激效应。 从 80 mol/L 开始, 染毒 12h 对 CHO 细胞的增殖有明显的抑制作用,表现出细胞毒性作用。 (2)双酚 A 可引起 CHO 细 胞的拖尾率、尾部 DNA 百分含量、尾长及 Olive 尾矩增加。提示双酚 A 可引起体 外培养的细胞产生 DNA 的单链损伤。(3)双酚 A 能显著增加 CHO 细胞的微核 率和染色体畸变率。 其中染色体畸变
2、的类型以断裂、 无着丝粒断片和裂隙为主。(4) Ames 试验未检测到双酚 A 的致基因突变作用。在活化和非活化条件下,与阴性对 照组相比,可见部分菌株的回变菌落数有增加趋势,但并无统计学意义。提示双 酚 A 可能并不存在致基因突变的作用。 关键词:双酚 A;遗传毒性;单细胞凝胶电泳试验;Ames 试验;染色体畸变 试验;微核试验;中国仓鼠卵巢细胞 作 者: 蔺 瑶 指导老师: 田海林副教授 双酚双酚 A遗传毒性研究遗传毒性研究 英文摘要英文摘要 III Study on the genotoxicity of bisphenol A Abstract Objective: Bisphenol
3、 A (BPA) is a widely used endocrine disrupting chemical(EDC),additive of BPA can make the plastic products legerity durable, transparent, and strengthening the ability of impact resistance, these additives can effectively prevent the erosion of internal metal containers with fruits and vegetables, t
4、herefore, BPA is often used to manufacture polycarbonate, epoxy resin, food packaging, dental filling agent, canned food coatings and medical equipment. It may cause adverse effects on human bodies if exposed for long term at low dosages. However, most previous reports have focused on the toxic effe
5、cts of BPA. As most of the current studies of BPA focus on endocrine system, reproductive system, nervous system, etc., and its genotoxicity effect remains further study, the objective of this research is to study the cytotoxicity, DNA damage, mutagenicity effect, frequences of micronucleus and chro
6、mosome aberration through the experiments in vitro, which provide the laboratory data of different genetic end points of BPA. Methods: (1) CHO cells were used as the test cell line. Cytotoxicity of BPA was determined by MTT cell proliferation assay to investigate the change of survival rate of CHO c
7、ells exposed to different dosages at different exposure periods. (2) Single cell gel electrophoresis (SCGE) was used in order to detect the DNA single-strand breaks of CHO cells exposed to different dosages of BPA. (3) The micronucleus test was carried out in CHO cells and the frequencies of micronu
8、cleus were evaluated after exposed to different dosages of BPA. (4) Chromosome aberration test was used to determine the frequencies of chromosome aberration of CHO cells exposed to different dosages of BPA. (5) Ames assay was used to detect the mutagenicity effect of different concentration of BPA.
9、 Result: (1) The result of MTT assay showed that CHO cell proliferation increased significantly by the effect of BPA at low dosage group ( treated 12 and 24 hours at the concentration of 40 mol/L BPA) ( P 2),且有统计学意义( P0.01),说 明Ames试验检测系统正常,试验成立。以DMSO溶解,无论在非活化和活化条件 下,DMSO溶解液对TA97、TA98、TA100、TA102和TA1
10、535 菌株的回变菌落数均 不高于阴性对照组的两倍(即MR2 双酚双酚 A遗传毒性研究遗传毒性研究 第三部分第三部分 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames 试验)检测双酚试验)检测双酚 A致突变性致突变性 25 25 图4 低剂量组BPA对各菌株自发回变数的影响 注:图4-1为TA97菌株活化组自发回变数,图4-2为TA102菌株活化组BPA30 g/皿回变菌落数, 图4-3为TA102菌株活化组BPA270g/皿回变菌落数,图4-4为TA98菌株活化组阳性对照组回变 菌落数。 2.2 高剂量 BPA 染毒组的 Ames 试验结果 因为在前面的实验中, 没有检测到回
11、变菌落数明显增加, 因此提高了BPA的浓 度。BPA染毒剂量分别为810、1620、2430、5000 g/plate时,在非活化及活化条件 下,TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株的回变菌落数均少于阴性对照组 回变菌落数的2倍(即MR2) 。其中TA97菌株在活化和非活化条件下,与阴性对 照组比较回变菌落数均有所增加, TA102组在活化条件下回变菌落数与阴性对照组 相比有所增加,TA98和TA100菌株在非活化条件下回变菌落数与阴性对照组相比 第三部分第三部分 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames 试验)检测双酚试验)检测双酚 A致突变性
12、致突变性 双酚双酚 A遗传毒性研究遗传毒性研究 26 26 也有所增加,但各剂量组与阴性对照组相比并无可重复的统计学差异的回变菌落 数增加。阳性对照组的回复突变数显著高于阴性对照组的2倍(MR2),说明Ames 试验检测系统正常,试验成立。结果见表6、图5。 表6 高剂量BPA染毒组Ames试验回变菌落数 分组 活化系统 TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 DMSO 非活化 198.00 15.01 38.00 2.52 151.67 14.61 270.67 34.26 21.67 1.26 活化 199.33 62.12 39.00 9.50 152.67 13.07
13、 268.67 23.95 22.33 4.99 810 g/皿 非活化 220.00 43.27 36.00 11.14 166.00 28.35 270.67 47.72 18.67 3.06 活化 207.33 22.74 46.00 19.08 155.33 27.74 282.67 38.02 21.00 1.00 1620 g/皿 非活化 224.00 33.65 34.67 9.02 172.00 22.72 289.33 26.03 20.00 5.57 活化 240.00 27.06 34.67 13.87 164.00 20.30 326.67 55.47 20.67 3.
14、06 2430 g/皿 非活化 213.33 26.03 36.33 11.06 176.33 27.79 293.33 32.33 25.33 6.11 活化 240.67 37.43 30.33 7.09 161.33 35.57 297.33 40.22 25.00 8.89 5000 g/皿 非活化 229.33 29.28 41.33 6.66 180.67 21.94 318.67 36.07 22.67 9.45 活化 248.67 36.07 34.33 7.64 186.00 34.12 292.00 48.12 28.33 5.86 阴性对照 组 非活化 170 44.68
15、 32.67 6.11 150.00 23.07 302.00 47.62 22.67 4.16 活化 172.00 22.72 39.67 4.72 155.33 31.13 261.33 45.49 25.33 3.06 阳性对照 组 非活化 1178.67 218.47* 921.33 173.72* 994.00 134.18* 1732.00 319.49* 302.00 56.11* 活化 1133.00 291.56* 842.67 222.48* 1022.67 120.09* 1192.67 187.77* 232 30.27* *表示致突变比值MR2 双酚双酚 A遗传毒性研
16、究遗传毒性研究 第三部分第三部分 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames 试验)检测双酚试验)检测双酚 A致突变性致突变性 27 27 图5 高剂量组BPA对各菌株自发回变数的影响 注: 图5-1为TA100菌株活化组BPA810 g/皿回变菌落数, 图5-2为TA102菌株活化组BPA1620 g/ 皿回变菌落数,图5-3为TA1535菌株活化组BPA5mg/皿回变菌落数,图5-4为TA100菌株活化组 阳性对照组回变菌落数。 3 讨论 Ames试验检测致突变性的原理是:鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸缺陷型菌株无法 在无组氨酸的培养基上生长,但可以在含组氨酸的培养基上生长。
17、然而在有致突 变物存在时,在无组氨酸的培养基中沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株可回复突变成野 生型,从而可在无组氨酸的培养基上生长37。Ames试验的常用菌株有鼠伤寒沙门 氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535标准菌株,其中TA97和TA98菌株检测 移码突变,TA1535和TA100检测碱基置换突变,TA102菌株对醛、过氧化物及DNA 交联剂较敏感。在多种检测化学物致突变性的生物学短期试验中,以Ames试验应 第三部分第三部分 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames 试验)检测双酚试验)检测双酚 A致突变性致突变性 双酚双酚 A遗传毒性研究遗传毒性研
18、究 28 28 用最广, 因其测试结果与化学物质引起的动物致突变性最为符合。 化学物质的致突 变性和致癌性有显著的相关性,有不少致突变物同时也是致癌物,而多数致癌物 也兼具致突变作用。因此,可以根据致突变性测试的结果间接推断受试物可能的 潜在致癌性。根据评价标准,各浓度组的菌落数与阴性对照组的自发回变菌落数 相比,如果受试物诱发的回变菌落数为阴性对照组的2倍或者2倍以上,且有剂量- 效应关系,或某个测试点的回变菌落数超过阴性对照组的2倍或以上,且呈现可重 复性,具有统计意义,即可判定为阳性结果。若受试物在重复的两次实验中,均 不引起剂量相关性的回变菌落数增加,且在任何测试点均没有可重复的、有统
19、计学 意义的回变菌落数增多, 则可将该受试物在本试验中的结果判定为阴性。 虽然Ames 试验有许多优点,可以作为致突变剂的初筛。然而,Ames试验也存在某些不足之 处:该方法不适用于检测含组氨酸成分的样品,可能出现假阳性结果38;尽管该 体系中用于检测的菌株有多个,但是其突变的类型有限,不能兼顾全部突变类型, 有可能会产生假阴性结果39;该方法所用的检测菌株均属原核生物,该组菌株的 酶系及其代谢机制与真核生物有所不同,即便添加S9系统(哺乳动物肝微粒酶激活 系统),其结果也并不能完全反映实际的代谢情况40;Ames检测中存在许多不确定 性,阳性结果的判断并不是单纯的2倍关系就可以确定41;Am
20、es试验方法操作过 程比较繁杂,不适用于高通量检测等。 Dinesh等10为探讨BPA的致突变作用进行了Ames实验。实验选取TA 98, TA 100 和TA 102为测试菌株,结果显示,在非活化条件下,BPA各浓度组对各组菌株 均无致突变作用。但在活化条件下,各菌株在BPA浓度从6.25g至25g浓度组均可 观察到轻微的自发回变数增加,其中TA102菌株在BPA浓度为25g/皿时有显著的 统计学差异。因此该研究推测BPA可能存在潜在的氧化应激损伤作用,BPA的代谢 产物可能是引起氧化应激的原因。 在本研究中,非活化及活化条件下,10-5000g/plateBPA作用于TA97、TA98、
21、TA100、TA102和TA1535菌株后的回变菌落数均低于阴性对照组回变菌落数的2倍 (即MR2) ,Ames试验结果均为阴性,该结果与Dinesh等10的研究结果相吻合。 有所不同的是,虽然部分菌株的回变菌落数与阴性对照组相比有所增加,但各剂 量组与阴性对照组相比并无可重复的统计学差异的回变菌落数增加。与彗星试验、 微核试验和染色体畸变试验得到的阳性结果相比,Ames试验中并未发现BPA的致 双酚双酚 A遗传毒性研究遗传毒性研究 第三部分第三部分 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames 试验)检测双酚试验)检测双酚 A致突变性致突变性 29 29 突变性,造成这一
22、结果的原因可能是多方面的:首先,以上遗传毒性试验检测的 终点不同,彗星试验是反映DNA的原始损伤,微核试验和染色体畸变试验反映染 色体结构的改变,而Ames试验主要是检测基因突变,包括基因组碱基置换型或移 码型突变。其次,Ames试验所用的检测菌株均属原核生物,该组菌株的酶系及其 代谢机制与真核生物有所不同,即便添加S9系统,其结果也并不能完全反映实际 的代谢情况40。此外,Ames试验检测中存在一定的不确定性,阳性结果的判断并 不是单纯的2倍关系就可以完全确定41。Sieratowicz等42的研究结果表明,BPA与 其他环境内分泌干扰物相比,引发遗传毒性的浓渡相似或更低。 综上所述,因为A
23、mes试验为原核体系,菌株本身存在一定局限性,还需要结 合其他试验的结果,如基因突变试验、染色体畸变试验、微核试验以及体内遗传 毒理学试验来对BPA的致突变性作出正确评价。 结结 论论 双酚双酚 A遗传毒性研究遗传毒性研究 30 30 结 论 1.体外培养条件下,当染毒浓度为 40mol/L,作用 12h 后,双酚 A 对 CHO 细胞有显著的刺激生长作用,表现出一定的刺激效应。从 80mol/L 开始,双酚 A 对 CHO 细胞的增殖产生明显的抑制作用,表现出细胞毒性作用。 2.单细胞凝胶电泳试验结果表明,双酚A可引起CHO细胞的拖尾率、Tail DNA%、尾长及Olive尾矩增加。提示双酚
24、A可在体外条件下引起直接的DNA损伤。 3.微核试验和染色体畸变试验表明,双酚 A 能显著增加 CHO 细胞的微核率和 染色体畸变率。其中染色体畸变的类型以断裂、无着丝粒断片和裂隙为主,表明 双酚 A 可致细胞染色体畸变和微核形成。 4.Ames 试验结果为阴性。虽然染毒组部分菌株的回变菌落数有所增加,但并 无统计学意义。提示双酚 A 可能并不存在致基因突变的作用。 双酚双酚 A遗传毒性研究遗传毒性研究 参考文献参考文献 31 31 参考文献 1 Carlsen E, Giwercman A, Skakkebaek NE. Declining sperm counts and increasi
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