壳聚糖衍生物对糖尿病大鼠血糖的调节作用研究.pdf
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1、壳雅始糖R H m # H n 月A 壳聚糖衍生物对糖尿病大鼠血糖的调节作用研究 摘要 糖尿病( D M ) 足由于胰岛素分泌量绝对或相对不足引起具有遗传性, 属于常见的内分泌代谢疾病之一,l 播床上通常农现为慢性山糖升高和典型的“三 多少”症状。 甲壳素广泛存在于甲壳纲动物( 如虾和蟹等) 、昆虫的甲壳和真菌( 如酵母、 霉菌等) 中,是一种N 一乙酰D 葡萄糖胺的多聚糖。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化 产物,为白色固体,形状无定形,呈现半透明、略带珍珠光泽,是一种具有多种 生物活性的碱性多耱。对甲壳素和壳聚糖的分子结构进行修饰,得到不同结构的 水溶性壳聚糖衍生物。可使它们的性能得到改进,满足特殊
2、需要。大分子量的壳 聚糖经过降解可以得到分子量较低的壳聚糖产物即低聚合度壳聚糖,这类产物 较壳聚糖有更好的水溶性,并且更加利于机体吸收利用,具有更广泛的应用价值。 本论文以大分子量的壳聚糖为原材料,通过化学合成方法和生物酶降解法制 各了低脱乙酰度的低聚壳聚糖、磺酸化壳聚糖和羧甲基甲壳素,通过测定它们的 相关理化性质,了解三种壳聚糖衍生物的结构。 在动物水平上,以全雄W i s t a r 大鼠为研究对象,通过一次性腹腔注射链脲佐 菌素建立糖尿病大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为正常对照组和模型对照 组,每日分别灌胃一定体积的蒸馏水:低脱乙酰度壳聚糖组( 2 0 0 m g k g ) 、磺酸
3、化壳聚糖组( 2 0 0 m 啦g ) 、羧甲基甲壳素组( 2 0 0 m 卧g ) ,每日分别对大鼠灌胃 三种壳聚糖衍生物。连续灌胃4 5 天后测定空腹血糖变化和糖耐量改变,同时测 定大鼠体重变化,血脂,肝脏、脾脏、肾脏和胰腺的脏器指数,对大鼠胰腺、肾 脏和肝脏进行病理组织学切片观察。 在细胞水平上,以胰岛D 细胞为研究对象,三种壳聚糖衍生物为实验材料, 采用常规细胞培养方法培养R N m 5 f 胰岛细胞系,壳聚糖衍生物设定5 个浓度梯 度( 6 25 m g L 、1 2 5 m g ,L 、2 5 0 m g L 、5 0 0 m g ,L 和】0 0 0 m g ,L ) 并且设定空
4、白对 照组,通过M 丁T 法检测不同培养时间( 4 9h 、9 6h 、1 4 4h ) 胰岛1 3 细胞的增殖 隋况,并计算细胞增殖率( p r o l i f e r a t i o nr a t e ,P R ) :A I A o x1 0 0 ,实验重复3 次。 实验结果及结沦如下: 1 低脱乙酰度壳聚糖、羧甲基甲壳素、磺酸化壳聚糖的理化性质如下,水分含量 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 些! ! ! ! ! ! ! 分别为59 、5 4 7 、5 , 6 4 ,扶分吉量分别为10 6 、l0 9 、】8 7 3 6 ,脱乙 酰度分别为4 85 3 、1 02 3 、3
5、 75 3 ;羧甲基甲壳豢的羧化度为9 86 5 ,磺酸 化壳聚椭的磺酸化度为8 83 红外光谱删定结果显示,低脱已酰度C T 8 在3 4 4 0 c m 。、1 6 5 0c m 。、1 5 5 7c m 、1 0 7 1c m 。具有特征性吸收峰:C M C 在3 4 4 3c m 一、 1 6 4 9c m 。、1 4 l7c m 。、1 0 6 9c m 1 具有特征性吸收峰;磺酸化壳聚耱在1 2 3 2 c m 。、 7 9 9 c m 。处有特征哦收峰,均具有良好的水溶解性。 2 糖尿病大鼠灌胃4 5 天后,三种壳聚糖衍生物对空腹血糖均有不同的降低作用, 其中低脱乙酰度壳聚糖组和
6、羧甲基甲壳素组的降糖效果较好,3 0d 时出现显著 性差异( P M w1 2 0 0 0 “ 肝素2 1 0 0 0 “ M w 5 4 0 0 0 。 硫酸酯化壳聚糖具有抗肿瘤、抗病毒的功能等1 1 6 17 1 。S h a r o n V V 等人证明 了磺酸化壳聚糖具有增强免疫力、抑制病毒感染的功能,可以通过抑制H I V - I 逆 g m 物“ # R 病 H m * * 作R 转录酶的活性及控制H J v - I 的复制半衰j I | 浓度为7 1 a g m l ,柬防治_ ;! = 滋病毒l I I V 的感染。增加H I V - I 的复制半衰期浓度对H I V 1 蛋白
7、的合成速率起到加速降低的 作用,同时抑制单纯疱疹病毒I 币I 以及劳台氏白血璃病毒。H o r t o n D 和J u s tE K 研究汪明了氮基上接枝了硫酸根的壳聚糖衍生物对于白I 缸病有显著的抑制作川 1 19 1 。另外,l s h i h a r aC 等人2 0 2 1 锰明了羧甲基甲壳素不具有抑制单纯疱疹病毒、 仙台病毒和弗兰德鼠白血病病毒的作用但是硫酸酯化的甲壳素具有抗病毒活 性,由此可见接枝的硫酸基团发挥了抑制病毒的功能。 硫酸酯化壳聚糖具有免疫功能,M u r a t aJ1 2 2 啪S a i k i1 1 2 3 1 通过比较肝索和硫酸 酯化的壳聚糖对肿瘤的抑制作用
8、,详细地研究了它的作用机理硫酸酯化壳聚糖 可以抑制生成诱导肿瘤产生的的血管,肿瘤的营养源被切断,阻止了肿瘤的转移 对癌扩散的抻制率达到8 0 8 5 ,优于肝素的是没有任何副作用e l332 0 酰化和N 酰化壳聚糖 甲壳素和壳聚糖可以同酸酐、酰卤( 主要是酰氯) 等多种有机酸的衍生物发 生反应,不同分子量的芳香族或腊肪族酰基引入多糖链。壳聚糖发生N 一酰化反应, 产生N 一乙酰壳聚糖即甲壳素,是一种非常有用的反应。若用丙酸酐、丁酸酐、己 酸酐代替乙酸酐,则可得到相应的酰化产物1 。用二酸酐( 丁二酸酐、顺丁烯二 酸酐、邻苯二酸酐等) 作为酰化剂,得到壳聚糖的酰胺酸衍生物,它们的溶解性 增强,
9、溶剂范围更广泛,包括水、稀碱、稀酸和一些有机溶剂等,并且显示了良 好的吸湿性和保水性# 5 。2 6 I 。 13 4 低聚合度壳聚糖 大分子量的壳聚糖经过降解,可以得到分子量较低的壳聚糖产物即低聚合度 壳聚糖,这类产物较壳聚糖有更好的水溶性,并且更加利于机体吸收利用,具有 更广泛的应用价值,并已经成为了人们普遍关注和重点研究的领域。制各低聚合 度的壳聚糖、甲壳素的方法主要有酸水解法、氧化法和生物酶降解法。 】3 4 1 酸水解法 常见的酸水解法主要包括咀下几种;盐酸法、磷酸法、乙酸法和氢氟酸法。 酸性水溶液中的壳聚糖不能够稳定存在糖苷键断裂导致糖链发生水解,形成一 些分子量大小不等的糖链片断
10、,过度水解可以生成单糖。由于酸水解法水解程度 不易控制,在制各寡糖的时候,纯化困难,产物主要是单糖和顾糖混合物,很难 壳聚糖衔生物埘糖尿病太鼠m 稽的* 节作用”究 针对性得到所需的活性寡糖,产品质量较低,限制了酸水解方法的推广应用。 1342 氧化法 目前研究较多的氧化降解法主要为过氧化氢洼。覃彩芹等1 2 7 1 证明,以盐酸等 强酸为介质,卜r 浓度较高,结合到壳聚糖的糖链氨基上,形成R N H 3 + 的缺电子 体系,使H2 0 2 主要进攻B - ( 1 4 ) 糖苷键,由于氧化糖苷键断裂壳聚糖分子链降 解。此方法的工艺较简单,易于规模化生产,但是由于水解过程破坏了壳寡糖分 子结构,
11、可产生副产物,产品的品质较低。另外,氧化降解法还有次氯酸钠法和 过硼酸钠法等。 13 43 生物酶降解法 生物酶降解法为利用专一性或非专一性生物酶降解甲壳素或壳聚糖的一种 绿色环保的方法,近年来对此法的研究逐渐增多。由于整个降解过程耒加入其他 反应试剂反应条件温和几乎没有副反应,因此具有较广泛的应用研究价值。 常用的工具酶主要包括溶菌酶、脂肪酶等非专一性的水解酶以及壳聚糖酶和甲壳 素酶等专一性的水解酶目前已经可以规模化生产。 甲壳素酶( C h i t i n a s e ) 可以专一性水解线性结构的乙酰氨基葡糖苷键,得到 最终水解产物为二糖,分布广泛,在细菌和放线菌等微生物、植物组织及动物消
12、 化系统中均有发现,相比壳聚糖酶( C h i t i s a n a s e ) ,甲壳索酶的降解速度较慢。因 为当壳聚糖溶解于烯酸溶液时,更容易与壳聚糖酶发生水解反应,最终水解产物 也是二糖,可以进一步被氮基葡萄糖酶水解为氮基葡萄糖。 1 4 甲壳素、壳聚糖及其衍生物与糖尿病 近年来,国内外关于甲壳素和壳聚糖缓解糖尿病相关症状的研究逐渐增多。 据文献报道,在治疗糖尿病方面,甲壳素、壳聚糖及其衍生物主要发挥以下几个 方面的作用: 1 41 调节血糖的作用 众所周知,治疗糖尿病重点在于有效控制和降低血糖。有研究表明壳聚糖 可以明显降低四氧嘧啶诱导的糖尿病模型大鼠的血糖浓度,同时增高大鼠血清胰
13、岛素含量【“I ;郑铁生等1 2 9 1 研究表明,对于四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠,龙虾 壳聚糖可以明显降低其血糖水平并且改善糖耐量:壳聚糖安全无毒副作用,与口 壳聚糖口I 生物“糖雠璃 鼠m 糖的调节作用究 服化学降糖药十f 1 比较,具有较好的降糖效果”:K o n d o 等研究认为壳聚糖可以通 过提高胰岛柔受体的敏感性达到降m 糖效果】。以L 研究结槊表明壳聚糖具有调 节血糖的功效。 另有研究显示,接枝共聚了新的化学基团的多糖衍q :物也可以降血糖,如肝 素和低分子量的壳聚糖等的硫酸酯化衍生物均具备降低血糖的活性3 2 - 3 3 1 :李绪 亮、焦庆才I ”I 等研究证明硫酸酯化的
14、茯苓多糖具有防止肾功能衰竭的功效,可以 防治腺嘌呤诱导的大鼠慢性肾衰竭。 l42 抗氧化作用 异常的自由基代谢对于糖尿病以及并发症产生异常严重的影响主要包括 册:( 1 ) 在体内,葡萄耱和蛋白质反应生成了A m a d o r i 产物,并最终产生A G E s 可结台其受体,在酶促反应下其受体结构与功能发生改变,产生大量自由基:( 2 ) 出现糖尿病及其并发症的原因之一是由于激活了多元醇的通路,如糖尿病性白内 障是由山梨醇激活导致的;( 3 ) 造成胰岛细胞损伤原因之一是:自由基代谢异常 导致转录因子N F 一。B 被A G E s 激活,进而生成大量N O ;( 4 ) N A D P
15、H 氧化酶的 活化是由于蛋白激酶C 活性的升高,进而引发自由基生成。 研究表明1 ,因为胰岛细胞中的S O D 和G S I I P x 等台量较少、活性较低很 容易受到自由基的损伤,所蚍当体内活性氧浓度的增高和胰岛素合成分泌的信号 通路受到影响时,胰岛B 细胞受到直接和间接损伤。此外,自由基通过激活多 种信号通路,导致胰岛素受体及底物发_ 二磷酸化反麻体内分泌的胰岛素量减少, 引发胰岛素抵抗。 143 调节血脂的作用 研究表明,由于壳聚糖带有正电荷,可以有效阻止胆固醇和甘油三酯的消化 吸收,并促进机体排出这些物质,有效减少了胆固醇和脂肪的体内积累,如将壳 聚糖加入高脂肪混合肥料的大鼠饲料中饲
16、喂2 周后,对照组的粪便中脂肪含量 明显低于实验组口8 州。饲喂雄鼠添加了2 5 壳聚糖的高脂肪混合饲料2 0 天, 雄鼠体内胆固醇含景降低了2 5 3 0 不仅没有影响雄鼠摄食和正常生长,而 且可以有效防止发生脂肪肝。当S T Z 诱导的1 l 型糖屎病模型大鼠的血液胆固醇 含量增高时,由于壳聚糖能够吸收胆汁酸并使胆固醇免遭胆固醇酶的催化,降低 了大鼠血液内的胆固醇浓度【“I ;杨铭锌等I “1 进行体外模拟消化过程的实验表明, m $ # W R m R m 镕* # 月R 胆汁酸:壳聚糖= 8 :】时,壳聚糖可以较好地发挥络合胆汁酸、阻止机体吸收脂 肪的功能:带有J 。电荷的壳臻糖促进机
17、体吸收胆固醇和胆汁酸,排出来被吸收的 脂肪,同时吸附食物中带负电的脂肪,从而使血脂含量降低I “J :王淑玲等1 4 ”也 证明了血清胆固醇和甘油三酯含量可以随着血糖降低而明显下降。另外有研究 认为壳聚糖结构中的氨基通过静电桥联作用吸附游离脂肪酸具有降脂作。 15 本论文研究目的 由于壳聚糖为一种天然生物大分子多糖,具有多种生物活性及良好的生物相 容性无毒副作用,近年来,有关于壳聚糖在降低血糖、抗肿瘤、降血脂、防感 染、增强免疫力等方面的作用研究不断增多。 本实验制备了三种壳聚糖衍生物,通过测定它们的相关理化性质,初步了解 三种壳聚糖衍生物的结构。在动物水平上以全雄W i s t a r 大鼠
18、为实验对象,通过 一次性腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠糖尿病模型,连续灌胃给药4 5 天,每1 5 天 测定一次空腹血糖和并于4 5 天时测定大鼠糖耐量变化,研究三种壳聚糖衍生物 对糖尿病模型大鼠血糖的调节作用:在细胞水平上,以K I N m 5 f 胰岛B 细胞系为 研究对象,检测三种糖对胰岛细胞体外增殖的作用,为壳聚糖衍生物调节糖尿病 大鼠血糖提供了理论依据。 壳聚糖衍生物w 糖屎确 鼠J m 轱的调* 作用q f 究 第二章壳聚糖衍生物对糖尿病大鼠血糖的影响 壳聚糖是种具有生物活性的天然碱性多糖,性质稳定且安全可靠,对人体 无毒副作用,近年来有关壳聚糖对掂尿病治疗的研究逐渐增多。已有文献报道
19、, 低分子量壳聚糖4 5 4 7 1 、甲壳低聚糖“I 、壳寡糖1 4 9 1 均可以调节糖尿病大鼠的血糖水 平。本实验制备了三种壳聚糖衍生物,对其物理化学性质进行测定,以雄性W i s t a r 大鼠为实验动物,链脲佐菌素一次性腹腔注射造模,定量灌胃治疗,4 5 天后,研 究了三种壳聚耱衍生物对于糖尿病犬鼠空腹血糖、葡萄糖耐量及血脂的影响,并 通过石蜡组织切片、HE 染色观察了肝脏、肾脏和胰腺组织的病理学变化。 21 壳聚糖衍生物的理化性质的测定 2 1 1 材料、试剂和仪器 实验材料 3 种壳聚糖衍生物:磺酸化壳聚糖、低脱乙酰度壳聚糖、羧甲基甲壳素均为本实 验室制各并纯化。 实验试剂 冰
20、醋酸,N a O H ,盐酸,浓硝酸( 9 5 A R ) ,明胶等均为国产分析纯 实验仪器 电热恒温干燥箱( D H G 一9 0 5 3 一A 型号)上海精密实验设备有限公司 真空干燥箱( D Z F 6 0 5 0 型号)上海精密实验设备有限公司 超纯水器( 2 0 0 0 D 型号)北京长风仪器仪表公司 棱光可见分光光度计( 7 2 3 N 型号) 上海精密科学仪器有限公司 电子分析天平( A L l 0 4 型号) 梅特勒一托利多仪器有限公司 傅里叶变换红外光谱仪( F I I R 4 8 0 0 S 型号) 日本岛津研究所 离心机( R S 一2 0 1 1 1 型号)湘仪离心机仪
21、器有限公司 D H 计( P H S 一3 C 型号) 上海精密实验设各有限公司 磁力搅拌器( 9 5 2 型号) 上海安亭电子仪器厂 冷冻干燥机 美国 2 l2 实验方法和步骤 壳聚稚m 一# 物”锗屎捕太融m 藉作用研究 2 12 1 溶解性删定 将定量的样品溶于蒸馏水配成】浓度,观察其水溶解性。 2 122 水分测定 称量瓶干燥到恒重,精确称取】克样品均匀平铺在瓶底。将干燥至恒重的 称量瓶置于L O S 恒温干燥箱,瓶盖半开,干燥3 小时,干燥后的称量瓶和样 品置于干燥嚣冷却到恒温,称重后再于1 0 5 恒温干燥箱干燥O5h ,重复此种操 作直至前后两次的称重结果之间的差异小于0 0 0
22、 2g 即为恒重,计算样品前后的 失重,即为样品水分含量: W IW 2 水分( ) = W 1 一W o W o :1 0 5 烘干至恒重的称量瓶的质量( g ) w 】:1 0 5 烘干前样品和称量瓶的质量( g ) W 2 :1 0 5 烘干后样品和称量瓶的质量( g ) 2 12 3 灰分测定 洗净、烘干的坩埚置于5 5 0 2 0 的马福炉中,充分灼烧0 5h ,将坩埚 从马福炉中取出后室温冷却约l 一2m i n ,置于干燥器中冷却0 5h ,冷却完毕后 进行称重。重复以上灼烧、冷却、称量过程,一直到前后两次称重的差异小于 0 0 0 0 5g 为恒重。 在已经灼烧至恒重的空坩埚中
23、称取2 5g 已经干燥至恒重的样品置于5 8 0 的马福炉中,充分炽烧灰化4h r ,待灰化完毕马弗炉降温至1 0 0 ,将坩蜗小 心取出,空气中冷却约1 m i n ,称重。再次放入5 8 0 马福炉中灼烧1h r ,冷却, 称重。重复以上操作直至前后两次称重之差小于0 0 0 Ig 为恒重。按照下式计算 灰分: w z W o 灰分( ) = w I w o W o :已经干燥至恒重的空坩埚的质量( g ) W I :坩埚加干燥样品的质量( g ) 糖m 生物列糖R H I n 诘的婀t ”月“ R W 2 :灰化后坩埚加灰分的质量( g ) 2l2 4 样品脱已酰度、鞍化度发硫酸根含量的
24、测定 ( 1 ) 磺酸化壳聚糖和低脱乙酰度壳聚糖的脱乙酰度测定 称取样I 拈0 Ig ( 精确至0 0 0 0 2g ) 置于1 0 0 m l 的三角烧瓶中加入I5 m l 0 l m o 儿的盐酸溶液于室温搅拌至样品完全溶解用O1m o l L 标准N a O Ha q 酸 碱滴定样品溶液,同时用数字酸度计测定并记录p H 随标准N a O H 溶液体积的变 化,采用一阶微商法找出两个突跃点。另外取一份相同的样品,于1 0 5 恒温 干燥箱中烘干至恒重,并测定水分含量。 按照下式计算脱乙酰度: ( V 2 一V I ) X Cx00 1 6 f 1 一D 1x00 9 9 4 v l :第
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