斑马鱼补体调节因子CFI基因的鉴定、功能初探及CFH家族成员的急相反应.pdf
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1、斑马鱼补体调节因子C F ! 基因的鉴定、功能初探及C F H 家族 成员的急相反应 补体调节因子J ( C F I ) 是哺乳动物补体系统的重要组成成分,发挥着免疫 调节的作用,在辅因子C 4 b p 、M C P 和C F H 的作用下通过酶解C 3 b 和C 4 b 分子 调节补体系统的过度激活。已有研究表明哺乳动物中C F I 有重要作用且与疾病 发生相关,但C F I 在其它物种中研究较少。斑马鱼作为一种重要的模式动物,其 基因组测序已经完成,与人类基因的保守性高达9 5 ,这使得斑马鱼适于研究基 因的表达与功能。本论文成功从斑马鱼中克隆了补体因子C F I 并分析了其特征、 表达,
2、对功能进行了初步探索,同时对C F I 的辅因子C F H 在胚胎发育中的表达 模式及其对L P S 和L T A 感染的应答进行了分析。 斑马鱼C F Im R N A 全K 为2 3 8 4 b p ,其中编码区为2 1 9 3 b p ,编码含7 3 1 个氨 基酸的蛋白质,多肽链的分子量为8 14 k D a ,等电点p l 为61 7 。与其它脊椎动物 C F I 蛋白的同源比对结果显示序列相似性高达3 55 6 71 ,且序列中存在大量 保守的半胱氨酸。C F I 蛋白具有段由1 8 个氨基酸组成的信号肤和5 个保守域, 即F I M A C 、S R C R 、L D L r l
3、 、L D L r 2 和s P 结构域。在信号肽与F I M A C 结构域之 间还有一段特异性的序列,这段序列可能是鱼类所特有的。成熟的C F I 是由重链 和轻链组成的异质二聚体,F I M A C 、S R C R 、L D L r l 和L D L r 2 组成重链,s P 结 构域组成轻链,在轻链中存在保守的催化三联体H i s A s p - S e t 和一个位子催化部 位底部的A s p 残基。作为一种分泌型糖蛋白,斑马鱼的C F I 序列中舍有O 糖基 化位点和N 糖基化位点,O 糖基化位点主要位于信号肽和F 1 M A C 结构域之间的 特异性序列区域N - 糖基化位点则
4、分散存在于整个C F I 序列之中。蛋白结构预 测显示斑马鱼C F I 蛋白同人C F I 蛋白的空问结构具有很高的相似性,这预示它 们功能上的相似性。进化分析显示,C F I 蛋白在进化上高度保守,哺乳动物C F I 基嗣聚为一枝斑马鱼与硬骨鱼的C F I 蛋白聚为一枝。L D L r l 结构域和L D L r 2 结构域的进化树中两个结构域各裳为。簇,在每一个结构域的分枝中表现出与 C F I 蛋白全瞄赴化树相同的聚类趋势。实时定量P C R 检测结果显示斑马鱼C F I 基因在并组织tJ ,J “泛表达,其中在卵巢、精巢、肝脏、脑、肠和眼中的表达量很 高。当受到L P S 蟮染时,甜7
5、 在肝脏中的表达最r 调。C F I 堆嗤l 和C F H 家族基 冈在不同发育时期胚胎中具有不J 司的表达模式,( “ 蜒因在胚胎发肯的体节期表 达量揖多,而大部分( 仰家族成员在】d p f 腓胎巾表达量开始显著增多,其中 C F H L 4 在胚胎发育整个过程中部具有很高的表达量。在体节期,当胚胎受到L P S 和L T A 感染时C F I 基因的表达量显著F 喘,而( 1 刖家族基蹦在胚胎发育不同 对期则呈现不同的应苔趋势,且表达量变化显著。推测C F H 家族基因在斑马鱼 胚胎发育过程巾,通过多种形式对朴体选径进行若精确的调控。胚胎整体原位杂 交结果显示,C F l 基因在胚胎发育
6、的过程中在卵黄合胞体上直具有特异性表 达,在体节期时信号最强。当胚胎发育至1 天对C F I 基因在松果体中也出现特 异性表达。这提示C F I 除了参与朴体调节外,可能在早期发育过程中也起重要 作用。初步实验表明过表达C F l m R N A 并没有可见的对胚胎发育的影响。同时, 还尝试了原核表达C 兀,体外诱导表达重组蛋白C F I 的大小为6 42 k D a 这为进 步在蛋白水平研究斑马鱼C F I 的功能奠定了基础。 关键词:斑马鱼:补体调节;C F I ;C F H C h a r a c t e r i z a t i o na n df u n c t i o n a la
7、n a l y s i so f t h ec o m p l e m e n t f a c t o r1a n da c u t ep h a s er e s p o n s eo f C F Hf a m i l ym e m b e r si n z e b r a f i s h A b s t r a c t T h ec o m p l e m e n ts y s t e mi nv e r t e b r a t e sp l a y sac r u c i a lr o l ei nt h ee l i m i n a t i o no f p a t h o g e n
8、 sT or e g u l a t ec o m p l e m e n to ns e l f - t i s s u ea n dt op r e v e n ts p o n t a n e o u s a c t i v a t i o na n ds y s t e m i cd e p l e t i o n ,c o m p l e m e n ti sc o n t r o l l e db yb o t hf l u i d p h a s ea n d m e m b r a n e b o u n di n h i b i t o r sO n es u c hi n
9、h i b i t o r , c o m p l e m e n tf a c t o rI ( C F I ) r e g u l a t e s c o m p l e m e n tb yp r o t e o l y f i cc l e a v a g eo fc o m p o n e n t sC 3 ba n dC 4 bi nt h ep r e s e n c eo f s p e c i f i cc o f a c t o r sC o m p l e m e n tf a c t o rH ( C F H ) ,t h em a i nc o f a c t o r
10、f o rC F I ,r e g u l a t e s t h ea l t e r n a t i v ep a t h w a yo f c o m p l e m e n ta c t i v a t i o nb ya c t i n gi nt h eb r e a k d o w no fC 3 b t oi C 3 bT og a i nf u r t h e ri n s i g h ti n l ot h er e g u l a t o r so fc o m p l e m e n ta c t i v a t i o ni nb o n y f i s h ,z e
11、 b r a f i s hC F lw a sc l o n e da n di t sc h a r i a c t e r i z a t f o na n df o n c t i o nw a ss t u d i e dT h e e x p r e s s i o no f C F H f a m i l yg e n e sa n dC F a n d t h e i rr e g u l a t i o nb yL P Sa n dL T Ad u r i n g t h eo n t o g e n yo f z e b r a f i s he m b r y o s l
12、 a r v a ew e r ea l s os t u d i e d T h ef u l l - l e n g t ho fz e b r a f i s hC F c D N As e q u e n c ei s2 3 8 4 b pa n de n c o d e sa p r e d i c t e dp r o t e i nw i t h7 3 1a m i n oa c i d sT h em o l e c u l a rw e i g h to fC F Ip r o t e i ni s 8 14 k D aa n dt h ep Ii s61 7I Is h a
13、 r e sa sh i g ha s3 55 - 6 7j a m i n oa c i di d e n t i t i e sw i t h o t h e rC F Io fv er f e b r a t e sT h e r ea r el o t so fc o n s e r v e dC y sr e s i d u e si nt h ep e p t i d e S i m i l a rt om a m m a l sC F I ,z e b r a f l s hC F Ih a sal e a d e rp e p t i d e ,F I M A C ,S R C
14、 R ,L D L r l , L D L r 2a n dS Pd o m a i n s ,e x c e p tt h a tt h e r ei sat e l e o s t - s p e c i f i cs e q u e n c eb e t w e e nt h e l e a d e rp e p t i d ea n dt h eF I M A Cd o m a i nT h em a t _ L l r eC F Ip r o t e i ni sah e t e r o d i m e rw i t h ah e a v yc h a i na n dal i g
15、h tc h a i nT h eh e a v yc h a i nc o n t a i n sF I M A C ,S R C R ,L D L r la n d L D L r 2d o m a i n sa n dt h el i g h tc h a i no n l yc o n t a i n st h eS Pd o m a i nI nt h eS Pd o m a i n , H i sA s p - S e tr e s i d u e sc o m p r i s et h ec a t a l y t i ct r i a da n dt h ec o n s e
16、r v e dA s pr e s i d u ei nt h e b o t t o mo ft h ec a t a l y t i cp o c k e tA sas o l u b eg l y c o s y l a t e dp r o t e i n ,t h ez e b r a f i s hC F I p e p t i d eh a s 5 N g l y c o s y l a t e d s i t e sw h i c hs c a t t e ro nt h ew h o l ep e p t i d ea n d8 O - g l y c o s y l a t
17、 e ds i t e sw h i c hl o c a t eo nt h er e g i o nb e t w e e nt h el e a d e rp e p t i d ea n dt h e F I M A Cd o m a i nf h e3 Ds t r u c t u r eo lz e b r a f i s hC F lI sq u i t es i m i l a rw i t ht h a io f h u m a n i n d i c a t i n gt h a ti tm a yp e r f o r mt h es a m ef u n c t i o
18、 nT h ep h y l o g e n e t i ct r e e ss h o wt h a t C F Ip r o t e i n sa r eh i g h l yc o n s e r v e dd u r i n gc 、+ o l u t i o na n dt h ez e b r a f i s hC F Ii sc l u s t e r e d w i t ho t h e rf i s hC F IT h eC F Ig e n eo lz e b r a f i s he x p r e s s e dw i d e l yi nv a r i o u st
19、i s s u e s a n dm a i n l yi no v a r yl e s t i z 1 i v er 1b r a i ni n t e s t i n e sa n de y e sC F H sa n dC F Ih a v e d i f l e r e n te x p r e s s i o np a t t e r n sd u r i n gt h eo n t o g e n yo fz e b r a f i s he m b r y o s l a r v a ea n d t h e yr e s p o n dd i f f e r e n t l
20、yt oL P Sa n dL T Ac h a l l e n g eW es p e c u l a t et h a tC F Hf a m i l y g e n e sp l a yi m p o r t a n tr o l e st h r o u g hd i f l h r e n lw a y sa n dr e g u l a t et h ec o m p l e m e n t a c t i v a t i o np a t h w a y sa c c u r a t e l yW h o l em o u n ti ns i t uh y b r i d i z
21、 a t i o ns h o w st h a tC F Ih a s ad y n a m i c e x p r e s s i o np a t t e r ni ne a r l ys t a g e , l ! e x p r e s s e sm a i n l y 抽Y S L i ne a r l ys m g e , a n dl a t e ro n ,i ts p e c i f i c a l l ye x p r e s s e si np i n e a lg l a n da n dY S LO v e r e x p r e s s i o no f C F
22、l m R N As h o w sn ov i s i b l ep h e n o t y p e ,b u tw h e t h e rC F Ii si n v o l v e di ne a r l yd e v e l o p m e n t s t i l ln e e d sf u r t h e r i n v e s t i g a t i o n I nv i t r oe x p r e s s i o no ft h er e c o m b i n a n tp r o t e i n C F I 。2 8 ah a sb e e np e r f o r m e
23、di nEc o l ia n dt h ep r o t e i nw eo b t a i n e di s6 42k D a ( M W ) , t h i sl a y e sab a s i sf o rf u r t h e rs t u d yo f z e b m f i s hC F If u n c t i o n K e y w o r d s :z e b r a f i s h ,c o m p l e m e n tr e g u l a t i o n ,C F I ,C F H 缩略语 英文全称 A c r y l a m i d e B i s a c D l
24、 a m i d e A m p c i l l i n a l t e r n a t ep a t h w a y A m m o n i u mp e r s u l f a t e 5 - B r o m o - 4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y l - p h o s p h a t e C 4b i n d i n gp r o t e i n c o m p l e m e n tf a c t o rH c o m p l e m e n tf a c t o rHr e l a t e d c o m p l e m e n tf a c t
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