松江鲈(Trachidermus fasciatus)组织蛋白酶B和L的基因克隆、蛋白表达与表达模式分析.pdf
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1、 口 口 力量只互硕士学位论文 目录 中文摘要1 A B S T R A C T :; 缩略词5 第一章文献综述6 1 1 松江鲈的研究情况介绍6 1 1 1 松江鲈的生物学概况6 1 1 2 松江鲈的历史分布与保护现状6 1 1 3 松江鲈的科学研究情况介绍6 1 2 组织蛋白酶的研究情况介绍7 1 2 1 组织蛋白酶名称的由来7 1 2 2 组织蛋白酶的分类与分布7 1 2 3 组织蛋白酶的研究状况概述8 1 2 4 组织蛋白酶的抑制剂研究简介1 2 1 2 5 组织蛋白酶在鱼类中的研究简介1 3 1 3 本研究的目的和意义1 4 第二章C a t h e p s i nB 的基因克隆、蛋
2、白表达与表达模式分析1 6 2 1 材料与方法1 6 2 1 1 材料1 6 2 1 2 实验方法2 0 2 2 结果与分析3 1 2 2 1 测序结果及序列分析3 0 2 2 2 活性位点、糖基化位点预测及结构域分析3 3 2 2 3 同源比对与进化树构建3 6 2 2 4 构建原核表达载体3 6 2 2 5 重组质粒转入表达菌株4 0 2 2 6 蛋白提取并纯化4 0 2 2 7C a t h e p s i nB 的组织分布与表达分析4 0 2 3 小结与讨论4 4 。羹Z 呈硕士学位论文 第三章C a t h e p s i nL 的基因克隆、蛋白表达与表达模式分析4 7 3 1 材料
3、与方法4 7 3 1 1 材料4 7 3 1 2 实验方法4 7 3 2 结果与分析4 9 3 2 1 测序结果及序列分析4 9 3 2 2 活性位点、糖基化位点预测及结构域分析5 1 3 2 3 同源比对与进化树构建5 5 3 2 4 构建原核表达载体5 9 3 2 5 重组质粒转入表达菌株5 9 3 2 6 蛋白提取并纯化5 9 3 2 7C a t h e p s i nL 的组织分布与表达分析6 0 3 3 小结与讨论6 3 第四章总结6 6 参考文献6 9 致谢7 9 I I t 口 o | 只霉硕士学位论文 C o N T E N T S A b s t r a c t ( C h
4、 i n e s e ) 1 A b s t r a c t ( E n g l i s h ) 3 C h a p t e r1I n t r o d u c t i o n 6 1 1 R e s e a r c ha d v a n c ea b o u tR o u g h s k i nS c u l p i n 6 1 1 1B i o l o g yg e n e r a lo f R o u g h s k i nS c u l p i n 6 1 1 2D i s t r i b u t i o na n d p r o t e c t i o n o f R o u g h
5、 s k i nS c u l p i n 6 1 1 3S c i e n t i f i cr e s e a r c hs i t u a t i o no f R o u g h s k i nS c u l p i n 6 1 2R e s e a r c ha d v a n c ea b o u tc a t h e p s i n s 7 1 2 1O r i g i no f t h en a m e “c a t h e p s i n s ”7 1 2 2C l a s s i f i c a t i o na n dd i s t r i b u t i o no fc
6、 a t h e p s i n s 7 1 2 3R e s e a r c hs i t u a t i o na d v a n c eo f c a t h e p s i n s 8 1 2 4R e s e a r c hs i t u a t i o na b o u ti n h i b i t o r so fc a t h e p s i n s 。1 2 1 2 5R e s e a r c hs i t u a t i o no f c a t h e p s i n si nf i s h 1 3 1 3O b j e c t i v e sa n ds i g n
7、i f i c a n c e so f t h i ss t u d y 1 4 C h a p t e r2G e n ec l o n i n g ,p r o t e i ne x p r e s s i o na n da n a l y s i so fc a t h e p s i nB 16 2 1M a t 舐a l sa n dm e t h o d s 1 6 口 2 1 1M a t e r i a l s 1 6 2 1 2M e t h o d s 1 9 2 2R e s u l t sa n da n a l y s i s 3 0 2 2 1S e q u e
8、 n c ea n a l y s i s 3 0 2 2 2F o r c a s t i n go fa c t i v es i t e s g l y c o s y l a t i o ns i t e sa n da n a l y s i so fs m J c t u r a l d o m a i n 3 3 2 2 3H o m o l o g ya n dp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p 3 6 2 2 4C o n s t r u t i o no f p r o k a r y o t i ce x p r
9、e s s i o nv e c t o r 3 6 2 2 5R e c o m b i n a n tv e c t o rs w i t c hi n t oB L 2 1 3 9 I I I 乒| 鼻孥硕士学位论文 2 2 6P r o t e i nc o l l e c t i o na n dp u r i f i c a t i o n 3 9 2 2 7D i s t r i b u t i o na n de x p r e s s i o na n a l y s i so fc a t h e p s i nB 4 0 2 3D i s s c u s s i o n
10、4 4 C h a p t e r3G e n ec l o n i n g p r o t e i ne x p r e s s i o na n da n a l y s i so fc a t h e p s i nL 4 7 3 1M a t e r i a l sa n dm e t h o d s 4 7 :;1 1M a t e r i a l s 4 7 3 1 2M e t h o d s 4 7 3 2R e s u l t sa n da n a l y s i s 4 9 3 2 1S e q u e n c ea n a l y s i s 4 9 - 3 2 2F
11、o r c a s t i n go fa c t i v es i t e s ,g l y c o s y l a t i o ns i t e sa n da n a l y s i so fs t r u c t u r a l d o m a i n 51 _ 3 2 3H o m o l o g ya n dp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p 5 5 3 2 4C o n s t r u t i o no f p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r 5 9 3
12、2 5R e c o m b i n a n tv e c t o rs w i t c hi n t oB L 2 1 5 9 3 2 6P r o t e i nc o l l e c t i o na n dp u r i f i c a t i o n 5 9 3 2 7D i s t r i b u t i o na n de x p r e s s i o na n a l y s i so f c a t h e p s i nL 6 0 3 3D i s s c u s s i o n 6 3 C h a p t e r4S u m m a r y 6 6 R e f e r
13、e n c e s 6 9 A c h l o w l e d 脬n e n t s 7 9 - 口 1 - J 一 口 厶| 只季硕士学位论文 中文摘要 松江鲈( T r a c h i d e r m u s f a s c i a t u s ) 为中国“四大名鱼“ 之一,具有较高的经济 价值和营养价值。其成年个体一般体长1 2 1 7 c m ,体重5 0 “ - - 1 0 0 9 ,为肉食性的 小型降海溯河洄游性鱼类。松江鲈以往主要分布在我国的渤海、黄海和东海沿岸 及沿海河流的下游,但是,近十几年来随着我国经济的迅速发展,自然环境受到 了较大破坏,特别是大多数工厂沿河流排污。而松江
14、鲈依赖于江河的入海口进行 生长和繁殖,这无疑大大压缩了它们的生存空间,据目前的资料来看,现仅分布 在鸭绿江、青龙河以及富春江流域。所以,松江鲈已经被列入国家二级保护动物; 同时,我国于2 0 0 7 年1 月在山东省文登市埠口镇的青龙河出海口处建立了首个松 江鲈自然保护区,本实验所用松江鲈即采自此保护区。 组织蛋白酶是一种水解酶,可以降解蛋白质或者多肽片段,使其从氨基酸与 氨基酸之间的肽键处断裂或者专一性的在氨基酸侧链处断裂。“组织蛋白酶“ 的 概念在2 0 世纪2 0 年代提出,关于它的研究则在以后的近一个世纪中迅速发展, 到现在为止,已经发现了几十个种类的组织蛋白酶。组织蛋白酶广泛分布于细
15、菌、 植物和动物中,是新陈代谢中必不可少的酶,它的生物学功能很多,比如参与免 疫应答、降解不需要的蛋白质以维持内稳态、在消化道内消化食物以及降解卵黄 蛋白供给胚胎发育等等,本论文重点研究了其在松江鲈体内的免疫应答作用,获 得了两个重要的组织蛋白酶的e D N A 序列,并以此为基础构建了原核表达载体, 表达并纯化了它们的蛋白;另外,还利用q R T P C R 技术测得了两种组织蛋白酶 在正常情况下和鳗弧菌刺激后在肝脏、鳃、血液和脾脏中的表达模式,并对此进 行了分析,推断这两种酶参与了松江鲈免疫应答的过程。 本论文获得了松江鲈的C a t h e p s i nB 和C a t h e p s
16、 i nL 的核苷酸序列。C a t h e p s i n B 的e D N A 序列全长为1 2 2 6 b p ,5 端非编码区11 8 b p ,3 端非编码区11 5 b p ,有 多聚腺苷酸( p o l y A ) 尾巴和加尾信号( A A T A A ) ,开放阅读框为9 9 3 b p ,编码 3 3 0 个氨基酸,氨基酸序列的N 端有一个1 8 个氨基酸的信号肽,成熟肽中含有 一C a t h e p s i nB 的特有功能区域O c c l u d i n gl o o p ( 含有21 个氨基酸残基) ;C a t h e p s i n L 的e D N A 序列全
17、长为1 4 0 4b p ,5 7 端非编码区5 3 b p ,3 端非编码区3 4 0 b p ,也有 多聚腺苷酸( p o l y A ) 尾巴和加尾信号( A A T A A ) ,开放阅读框为1 0 1l b p ,编码 厶茹只霉硕士学位论文 口 口 厶fZ 互硕士学位论文 A B S T R A C T R o u g h s k i nS c u l p i n ( T r a c h i d e r m u sf a s c i a t u s ) i so n eo ft h ef o u rm o s tf a m o u s f i s h e si n C h i n a
18、 T h e yh a v eh i g he c o n o m i ca n dn u t r i t i o n a lv a l u e B o d yl e n g t ho f r o u g h s k i nS o u l p i ni su s u a l l y12 - 17 c m ,a n dw e i g h ti sa b o u t5 0 10 0 9 R o u g h s k i n S o u l p i nw a su s e dt of i n di nt h eB o h a iS e a ,Y e l l o wS e a ,t h eE a s t
19、C h i n aS e ac o a s t sa n d e s t u a r i e so fs o m er i v e r s T h ee n v i r o n m e n tw a sd e s t r o y e dw i t hr a p i de c o n o m i cg r o w t h o fo u rc o u n t r yi nt h ep a s td e c a d e ,e s p e c i a l l ym a n yf a c t o r i e sd i s c h a r g e ds e w a g ei n t o t h er i
20、v e r s N e v e r t h e l e s s ,r o u g h s k i nS o u l p i nr e l y so nt h eh a b i t a ta te s t u a r i e sa n d p o l l u t i o no fe n v i r o n m e n tc o m p r e s s e st h e i rh a b i t a ti nn od o u b t N o wi td i s t r i b u t e so n l y i nt h eY a l uR i v e r ,Q i n g l o n gR i v
21、 e r 觚dF u c h u nR i v e r R o u g h s l ( i ns o u l p i ni sp r o t e c t e d 口 i no r d e rI Ii nC h i n a T h ef i r s tr e s e r v eo fr o u g h s k i nS o u l p i nw e r eb u i l ta te s t u a r yo f Q i n g l o n gR i v e r , W e n d e n gc i t y , S h a n d o n gP r o v i n c ei nJ a n u a
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