IL-2基因多态性与中国汉族人群特发性扩张型心肌.doc
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1、精品论文大集合IL-2基因多态性与中国汉族人群特发性扩张型心肌病的相关性研究1黄萍1,周斌2,张林2,刘星1,陈斌1,饶莉11 四川大学华西医院心内科,成都(610041)2 华西基础医学与法医学院,成都(610041)Email: 摘要:目的 研究中国西南地区汉族特发性扩张型心肌病(idiopathic dilated cardiomyopathy,IDCM)患者白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)基因启动子区-384T/G、-475A/T、-631G/A多态性与IDCM的相关性。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 技术分析中国西南地区无血缘关系的109例汉族ID
2、CM患者和210例正常对照者IL-2基因启动 子区-384、-475、-631位点的单核苷酸多态性。结果 IL-2基因启动子区-384位点TT+TG基因型频率和T等位基因频率在IDCM患者中升高,与 正常对照组相比有统计学差异(分别为95.41% vs. 87.62%,p=0.042 和72.94% vs. 64.52%, p=0.039);而IL-2基因-631位点与-475位点基因型和等位基因频率在IDCM组与正常对照组之 间无差异。结论 本研究首次表明IL-2基因启动子区单核苷酸多态性与人类IDCM间的相关性。 IL-2基因启动子区-384位点T等位基因可能会增加发生IDCM的危险性。
3、关键词:特发性扩张型心肌病;白细胞介素-2;单核苷酸多态性特发性扩张型心肌病(idiopathic dilated cardiomyopathy,IDCM)是一组以心室腔扩大 伴收缩功能障碍为特征的原因不明性心肌疾病,常导致进行性心力衰竭及左室收缩功能下 降、传导系统异常、血栓栓塞及心源性猝死,预后极差1。目前认为,三个因素可能与 IDCM 的发生有关,即遗传易感、病毒感染和自身免疫 2。研究表明,以 T 淋巴细胞活化为中心 的过度细胞免疫是 IDCM 弥漫性心肌受损的关键环节3。而白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2) 是影响 T 细胞活化的关键因子4,IL-2 系统及其引发
4、的 T 细胞活化异常可能是 IDCM 发生 发展的重要因素5 。近来发现,IL-2 基因启动子区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)可引起基因转录水平的变化,直接影响 IL-2 的表达,并与某些 T 细 胞介导的自身免疫相关性疾病的发生有关6-8。但目前国内外尚无 IL-2 基因启动子区 SNPs 与 IDCM 关系的报道。本研究旨在探讨中国西南地区汉族人群 IL-2 基因启动子区-384T/G、-475A/T、-631G/A 多态性是否与 IDCM 的发病有关联。1对象与方法1.1 对象病例组为 2002 年 12 月至 2006 年 6
5、 月经成都市多家三甲医院诊断的 IDCM 患者 109 例, 诊断依据1995 年中华心血管学会专题讨论会关于扩张型心肌病诊断标准;有持续性高 血压、冠心病、心脏瓣膜病等基础心脏病史,有长期大量饮酒史、肿瘤药物使用史,有糖尿 病、结节病、自身免疫疾病、骨骼肌病等系统性疾病病史者未入选。IDCM 组平均年龄(5714)岁,男性 68 例、女性 41 例。正常对照组为 210 例体检健康人,平均年龄(5411) 岁,男性 132 例、女性 78 例。所有受试对象均为无血缘关系的汉族人,均测量心率及血压 并进行超声心动图检查了解房室大小及心功能情况。1本课题得到教育部高等学校博士学科点专项基金(20
6、070610144)的资助。- 7 -1.2 方法(1) 基因组 DNA 提取及聚合酶链反应取受试者静脉血 1.5 ml,EDTA-Na2 抗凝,按酚-氯仿法提取基因组 DNA , -20 保 存备用。 PCR 扩增引物用引物设计软件 Primer3(http:/frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)设计,由 Invitrogen 公司合成。IL-2基因启动 子区 -475A/T 、 -631G/A SNP 的 检测采用 同一对引 物,引物 序列为 5-ATAGACATTAAGAGACTTAAAC-3和 5-GTAACTCAGAAAA
7、TTTTCTTTG-3;-384T/G SNP检 测 采 用 的 引 物 序 列 为5-ATTCACATGTTCAGTGTAGTTCT-3 和5-GTGATAGCTCTAATTCATGC-3。PCR 反应总体系 25l,含 10 pmol 引物,200 pmol dNTP,1.5 mmol/L MgCl2,75 mmol/L Tris HCl (pH 9.0),150 mmol/L KCl,2 mmol/L (NH4)SO4,50ngDNA 模板和 1.5 U Taq DNA 聚合酶。PCR 反应条件:94预变性 5 分钟,94变性 30 秒,62退火 45 秒,72延伸 55 秒,循环 36
8、 次,72延伸 7 分钟结束反应。用 1%的琼脂糖 凝胶电泳,检测特异性 PCR 扩增产物。(2)PCR 扩增产物的酶切鉴定 -475A/T、-631G/A 和-384T/G SNP 检测采用的限制性内 切酶分别为 Trul I、Rsa I 和 FspB I(Jingmei Biotech)。酶切反应总体系 10l,含 PCR 产物7.0l,ddH2O 1.0l,10Buffer 1.0l,10u/l 内切酶 1.0l。酶切反应条件:FspB I、Rsa I 酶为 37恒温水浴 2 小时;Trul I 酶为 65恒温水浴 1.5 小时。取酶切产物 3l 与 2l loading buffer(
9、溴酚蓝、二甲苯青凝胶上样缓冲液)混匀后加入 6%聚丙烯酰胺凝胶板,以 600v 电压 电泳 40 分钟,清洗后硝酸银染色,观察结果并记录拍照。(3) DNA 序列测定根据酶切后电泳条带结果,选择有多态性存在的条带以及一正常对 照组标本进行扩增产物 DNA 序列测定。测序前,首先采用 3S PCR Product Purification kit 3.0 对 PCR 产物进行纯化,纯化后的 PCR 产物送上海申能博采生物技术公司采用 ABI-377 毛细 管电泳仪自动测序。1.3 统计学分析直接通过凝胶电泳结果判读个体基因型,用直接计数法计算病例组和对照组样本基因型 频率及等位基因频率,经过 H
10、ardy-Weinberg 平衡检验确认样本的群体代表性。临床计量资 料中,正态分布数据用 xs 表示,非正态分布数据取其自然对数,正态化后进行分析。计 量资料两组间比较采用不配对 Studentt 检验,计数资料组间比较采用 X2 检验,P0.05 为 差异有统计学意义。2. 结果2.1 IDCM 组与正常对照组临床及超声心动图资料的比较由表 1 可见,IDCM 组和正常对照组的心率、左室结构及左室功能多项指标之间均存在显 著性差异(P0.05)。2.2 IL-2 基因384T/G 多态性分析用限制性内切酶 FspB I 消化 PCR 产物后,由于 22bp 的片段太短,电泳后不能观察到,G
11、G 纯合子只显示 109bp 一条带,TG 杂合子只显示 131bp 和 109bp 两条带,TT 纯合子显示131bp 一条带(图 1)。对 3 种基因型进行 DNA 序列测定(图 2),测序结果与酶切结果一 致。2.3 IDCM 组与正常对照组 IL-2 基因-384 位点基因型和等位基因频率的比较IDCM 组和正常对照组的 IL-2 基因-384T/G 多态性基因型分布符合 Hardy-Weinberg 遗传 平衡定律。由表 2 可见,与正常对照组相比,IDCM 组的 TT+TG 基因型及 T 等位基因频率 增高,差异有统计学意义(P0.05)。2.4 IDCM 组 IL-2 基因-38
12、4T/G SNP 不同基因型亚组临床及超声心动图参数的比 较IDCM 组 IL-2 基因-384T/G SNP 三种基因型之间以及 TT+TG 与 GG 基因型之间各项临床 及超声心动图参数比较,差异均无统计学意义(P0.05)(表 3)。2.5 IL-2 基因启动子区-475A/T 和-631G/A 多态性检测仅在-475 位点正常对照组中检测到 2 例 AT 基因型,其余 317 例均为-475AA 型; -631位点 319 例全部为 GG 基因型。两位点的基因频率分布在 IDCM 组与对照组之间无差异。3讨论越来越多的研究证实,遗传易感背景下,病毒感染后的自身免疫反应是导致 IDCM
13、发 生的重要因素。现已发现多种免疫分子基因多态性与中国汉族人群 IDCM 有关。如最近的 研究显示 IDCM 患者细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)表达异常,CTLA-4 基因 启动子区-1772C/T、-1661A/G SNPs 和外显子+49A/G SNP 与 IDCM 遗传易感性相关 9-10。 此外, 人类白细胞抗原(HLA)-DQA1*0501、HLA-DQB1*0303 和 HLA-A*03 等位基因被 认为与中国北方汉族 IDCM 的遗传易感性相关,是 IDCM 易感性的遗传标记;而 HLA-DQA1*0201 及 HLA-DQB1*0502,*0504 等位基因
14、则是 IDCM 的保护基因11-12。这些研 究表明,在中国汉族 IDCM 患者中,至少有一个亚群存在着遗传因素相关的自身免疫功能 异常。IL-2 是一种在机体细胞免疫中起核心作用的细胞因子,一方面,它诱导 T 细胞增殖和 分化;另一方面,它激活 Treg 发挥其抑制 T 细胞的作用13。因此,血清 IL-2 只有在一个相 对较窄的浓度范围内,才能使 T 细胞介导的自身免疫反应维持在正常状态;IL-2 水平过高 或过低都可能导致 IDCM 等自身免疫相关性疾病的发生14。早有研究发现,IDCM 患者及 其无症状左室增大亲属血中的 IL-2 水平异常增高15,而活化细胞膜上 IL-2 受体的数量
15、和密 度明显下降且其表达水平与左室舒张末压显著相关,表明 IL-2 系统及其引发的 T 细胞活化 异常可能是 IDCM 发生及血流动力学恶化的重要因素5。而 IL-2 水平受到遗传背景的影响。 研究显示 IL-2 基因启动子区 SNPs 可通过引起基因转录水平的变化而直接影响蛋白表达,并 与特定人群对某些 T 细胞介导的自身免疫相关性疾病,如多发性硬化、肾移植后急性排斥 反应、精神分裂症等的遗传易感性有关6-8 。既然 IDCM 的发生与遗传易感、IL-2 水平及 T 细胞活化异常有关,而 IL-2 基因启动子 区 SNPs 可影响 IL-2 表达并与某些 T 细胞介导的自身免疫性疾病相关,那
16、么 IL-2 基因启动 子区 SNPs 与 IDCM 之间也可能存在相关性,但目前国内外尚无二者关系的报道。迄今为止, IL-2 基因启动子区共发现 3 种 SNP,分别位于-384、-475 和-631 位点。本实验通过检测 319 例中国西南地区汉族人 IL-2 基因启动子区-384T/G、-475A/T 及-631G/A SNPs 的基因型频率 和等位基因频率发现,IL-2 基因-384 位点 TT+TG 基因型频率和 T 等位基因频率在 IDCM 患 者中升高,与正常对照组相比有统计学差异。这一研究结果表明在中国西南地区汉族人群中,IL-2 基因-384T/G 多态性与 IDCM 相关
17、,T 等位基因可能是 IDCM 的易感基因。-384T/G 多态性变异可能通过影响 IL-2 基因转录活性,干扰蛋白的表达和功能,导致 T 细胞活化异常 而对 IDCM 易感。而 IL-2 基因启动子区-475 和-631 位点 SNPs 在中国西南地区汉族人群中 为低频率分布(低于 SNPs 数据库-475T 3%、-631A 1%的频率,与欧洲的研究结果相似16), 二者的基因型和等位基因频率在 IDCM 组与对照组之间无差异。-475A/T 及-631G/A 多态性 可能与 IDCM 的易感性无关。本研究为全面探讨 IDCM 的易感基因提供了新的实验数据,为深入认识免疫紊乱及遗 传背景参
18、与 IDCM 的发病机制提供了新的理论依据。但是,在 IDCM 的发生过程中,遗传 结构及免疫功能的改变具有多样性和复杂性,SNP 在不同人种不同地区间的分布也存在显 著差异。因此,只有多地区、大样本的研究,并且同时对参与 IDCM 发病的多个基因、各 种可能因素进行全面研究,才能真正明确某一 SNP 在 IDCM 发病中扮演的角色,进而从根 本上揭示 IDCM 的发病机制。参考文献1Maron BJ, Towbin JA, Thiene G, et al. Contemporary Definitions andClassification of the Cardiomyopathies:
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