OCT4 介导的人羊水干细胞重编程【推荐论文】 .doc
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1、精品论文OCT4 介导的人羊水干细胞重编程秦明德,梁含思(苏州大学江苏省干细胞与生物医用材料重点实验室,苏州21,5000)5摘要:羊水干细胞(AFS)是一种干细胞生物学特征介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干 细胞,因此理论上的 AFS 可以更简单、高效的重编程为 iPS。为了进一步简化编程过程中,通过单因子法构建的 iPS 有待进一步研究。这里报告 OCT4 通过外源性表达能够独立诱导重 编程人 AFS 为 iPS 细胞。其中单因子人 AFS-IPS(AIPS)细胞像人胚胎干细胞表达类似的10全基因表达谱,后生状态,畸胎瘤的形成以及在体外和体内的多能性。我们的研究结果表明, 转录因子 OCT
2、4 是必要的和足够直接重新编程人类干细胞多能性。单因子 AFS-iPS 细胞的生成会产生病人特异性多能干细胞,无癌基因作为转基因,简化编程,进一步推动该领域的了 解重编程过程。关键词:羊水干细胞;诱导多能性干细胞;重编程15中图分类号:Q254文献标志码:ADirect reprogramming of human amniotic fluid stem cells byOCT4QIN Mingde, LIANG Hansi20(Soochow University,Jiangsu Province Key Laboratory of stem cells and biomaterials,
3、Suzhou,215000)Abstract: Amniotic fluid stem cell (AFS) is a kind of fetal stem cell with the stemness of between embryonic stem cell and adult stem cell, thus theoretically AFS is more easier and efficient to be reprogrammed into iPS. In order to further simplify the reprogramming process, the25cons
4、truction of AFS derived iPS by single factor remains to be studied. Here we report the generation of one-factor human iPS cells from human AFS cells by ectopic expression of OCT4 alone. One-factor human AFS-iPS (AiPS) cells resemble human embryonic stem cells in global gene expression profiles, epig
5、enetic status, teratoma formation as well as pluripotency in vitro and in vivo. Our results demonstrate that the transcription factor OCT4 is is required and sufficient to30directly reprogram human AFS cells to pluripotency. One-factor AFS-iPS cell generation will produce patient-specific pluripoten
6、t stem cells without oncogenes as transgenes, simplify theprocess of reprogramming that advance the field further towards understanding reprogramming.Key words: Amniotic fluid stem cell; Induced pluripotent stem cells; Reprogramming350引言诱导多能干细胞(iPS)细胞可由小鼠 1 2 和人类体细胞表达胚胎干细胞关键转录因子 获取,它提供了特定病人的 iPS 细胞疾
7、病模型和细胞替代疗法1-4。重编程的分子机制还不完全 清楚,因为在重编程过程中的几个不确定因素,如外源性基因所需数量,诱导靶细胞的异质性。 人类 iPS 细胞的临床应用需要避免癌基因 c-Myc 和 Klf4 5 的使用,在宿主的基因组,如 c-myc40癌基因的活化会导致小鼠嵌合体形成肿瘤 4 。为了简化,避免重编程因子作为转基因,单因子 OCT4 能够将小鼠 6 和人类神经干细胞 7 重编程为 iPS。羊水已知含有多种来自胎儿发育中 的细胞。据报道,从人类羊水细胞可以被重新编程为 iPS。利用四因子重编程系统,人羊水来源 的细胞可以快速有效地诱导出多能性 8 ;不使用癌基因人羊水细胞可由二
8、因子(Oct4 和 Sox2) 重编程为 iPS 9 。最近,一种新的人羊水干细胞(AFS)已被分离 10 。这种干细胞尽占 1%45的总细胞数,其表达干细胞因子受体 c-kit(CD117)。AFS 一种干细胞生物学特征介于胚胎干基金项目:教育部博士点新教师基金(20093201120011)作者简介:秦明德(1978 年 3 月),男,副教授,干细胞生物学. E-mail: - 8 -细胞(ESC)和成体干细胞的新型多能干细胞,表达标志物 OCT4,SOX2,NANOG 和 SSEA-4。 因此认为 AFS 可由单因子 OCT4 重编程为 iPS。1 材料与方法501.1 标本来源羊水标本
9、来自苏州市市立医院,受试者(19-21 周妊娠)同意并在苏州大学第一附属医院 和苏州市市立医院伦理委员会审查1.2 主要实验材料和仪器特级胎牛血清(GIBCO 公司);KnockOut 血清(GIBCO 公司);DMEM/F12 细胞培养基55(Hyclone 公司);FGF-based(PEPRO TECH 公司);非必需氨基酸(GIBCO 公司);四 型胶原酶(SIGMA 公司);慢病毒 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc(本实验室构建);抗 CEA、 SSEA3、SSEA4、TRA-1-60 和 TRA-1-81 鼠来源的单克隆抗体(ebiosience 公司);抗 Oct4,
10、 Nanog,SOX2 鼠来源的单克隆抗体(Santa Cruz 公司);倒置显微镜(Olympus 公司);EVOS型荧光显微镜(东胜创新生物公司)。601.3 人 AFS 和人胚胎干细胞分离和培养利用细胞表面特异性抗体 c-kit(CD117), 分离纯化人 AFS。AFS 细胞在 -MEM 培养 基中培养皿中生长含 15%胎牛血清(FBS),1%的谷氨酰胺和 1%青霉素/链霉素(Gibco, Invitrogen 公司,),添加 18%Chang B 和 2%Chang C 培养基(Irvine 科学圣安娜,加利福 尼亚)375% CO2。人类胚胎细胞系 SHhES2 金颖教授馈赠 11
11、 , 生长于 MEF,人类胚65胎干细胞培养基:DMEM 培养基生长(Gibco,罗克维尔,MD)含 20%血清替代品(Invitrogen, 卡尔斯巴德,CA),谷氨酰胺 1 毫米,0.1 毫米 -巯基乙醇,0.1 毫米的非本质的氨基酸,50 U / ml 青霉素加 50g/ml 链霉素和 4 毫微克/毫升 bFGF(Invitrogen 公司)。1.4 AFS 重编程单因子和二因子 iPS慢病毒生产:编码人类 EF1 载体 Oct4 和 Sox2 基因(教授雷肖 12 ,上海生物科学研70究所),使用 lipod293II(signagen,盖瑟斯堡,MD,www.signagenlabs
12、。com)共转染缺陷 辅助质粒转染 293T 细胞。含病毒上清转染后四十八小时,病毒转导,2104 羊水干细胞接种于 6 孔板。在细胞扩散以及培养皿,四种病毒的混合物加入。24 小时后,更换培养液与 新鲜 AFS 培养三天后细胞进行第二轮感染,可以获得了 98%以上的感染效率。第二轮感染的人类干细胞在培养皿中培养无 AFS 60mm 的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞。直到细75胞变小(约两个星期),圆形和簇状生长,细胞接种在 MEF 细胞二三周人胚胎干细胞培养 基培养皿 100mm。与典型的 ESC 细胞形态的殖民地(高细胞核向细胞质比)的出现和扩大。1.5 羊水干细胞及羊水干细胞来源 iP
13、S 鉴定羊水干细胞及羊水干细胞来源 iPS 鉴定包括:流式细胞仪分析,流式细胞仪在 FACScan80流式细胞仪进行(贝克曼 Coulter,CA)。单克隆抗体:CD29,CD73,SSEA-3 和 SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81(eBioscience,San 迭戈,CA,www.ebioscience。com);CD90,CD105,CD106 和 CD45(BioLegend,San 迭戈,CA,www.biolegend。com);CD34(BD pharmingen,San 迭戈,CA,www.bdpharmingen。org);CD133(美天旎生物科技,)。抗体
14、稀释至供859095100应商推荐的浓度(1 克/毫升)。RT-PCR 分析,使用 RNA 提取试剂盒(Qiagen 公司)根 据制造商的指示。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),thermoscript RT-PCR(Invitrogen)被 用来从 1g 总 RNA 合成 cDNA。进行 PCR 反应混合 1 cDNA 模板 L,250 nm 的每个引物,200M dNTP 混合,和 1 U Taq DNA 聚合酶在体积为 20L。免疫荧光染色,4%多聚甲醛 30分钟固定, 0.1%的 Triton-X-100 PBS 室温(RT)5 分钟穿透,3% BSA 30 分钟封闭。所有 抗体稀释
15、后 4C 过夜反应: Oct4,Sox2 和 Nanog(圣克鲁斯,圣克鲁斯,CA,www.scbt。com);SSEA-3 和 SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81(eBioscience,San 迭戈,CA,www.ebioscience。com)二抗(抗兔 Cy3,杰克逊 immunoresearch,1 / 200)孵育 1 小时,DAPI 细胞核染色为3 分钟。 BX-60 荧光微镜(奥林巴斯,索撒尔,米德尔塞克斯郡,英国,HTTP:/ /www.olympus。),AxioCam 数码相机拍摄及图像分析。基因芯片和 DNA 甲基化分析,全 基因表达分析使用 Affyme
16、trix 公司的人 U133 Plus 2 阵列芯片。Sequenom epityper 法用于分析 Oct4,Sox2 和 Nanog 启动子区域 DNA 去甲基化。三份生物学重复样品:人 AFS,1F,2F 人 AIPS 和人类胚胎干细胞(SHhES2)。实验和分析均在北京博奥生物有限公司完成。 畸胎瘤的形成,AiPS 细胞株 1x106 细胞联合小鼠 Matrigel 胶注射到 NOD-SCID。六到八周后,畸胎瘤取材,苏木精-伊红染色。2 结果2.1 人羊水干细胞分离及鉴定105110流式细胞仪分析人 AFS 的表面分子表达情况(图 1A)。所有 17 株人 AFS 细胞系具有相似 的
17、结果。AFS 细胞的血细胞系标志物(CD45 阴性),内皮细胞标记物(CD106)和造血干细 胞(CD34,CD133)为阴性。然而,AFS 间充质和神经干细胞的表面标志物为阳性,包括 CD29(透明质酸受体),CD73,CD90 和 CD105(Endoglin)。人胚胎干细胞特异性表面标志 SSEA-4 弱阳性,但 SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81 为阴性。流式细胞仪分析说明人 AFS 是一种介于 胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞。为了探讨 1F 和 2F AIPS 构建的可能性,比较了 ESC用于 iPS 重编程的几个标记基因的表达,在人 AFS 和人胚胎干细胞(图 1
18、b)。数据从 RT-PCR显示 c-myc、Rex-1 、Oct4 和 Nanog 表达较强;,中度表达的有 KLF4; AFS 细胞系中 Lin28阴性表达,SOX2 为部分细胞系表达。人 AFS 表达关键重编程因子,因此理论上人 AFS 可以使 用单因子或者二因子重编程为 iPS。115120125图 1。人干细胞标志物的表达。(一)表面抗原的表达是通过使用小鼠单克隆抗体的流式细胞仪进行(填充曲线)。所 有实验采用同种对照抗体(未填充曲线)。抗原测试,包括:CD73,CD90,CD105,CD29,CD34,CD133,CD45,CD106,SSEA-3和 SSEA-4,TRA-1-60,
19、TRA-1-81。(b)RT-PCR 对 AFS 和胚胎的五种细胞系(阳性对照)分析,检测基因为 Oct-4,Nanog,SOX2,KLF4,c-myc,REX1,Lin28。2.2 羊水干细胞来源单因子和二因子 iPS 构建及鉴定130在羊水干细胞来源 iPS 构建中采用了单因子和双因子诱导的方法(图 2A)。AFS(约 20000 个细胞)感染于(在 EF1 慢病毒载体 Oct4 基因),以及 1:1(在 EF1 慢病毒载体 Oct4 和 Sox2 基因)在 AFS 培养基中,98%以上的感染效率。本研究中测试三株 Sox2 阳性 AFS 细胞系,在 OCT4 单因子实验中由七个类胚胎干细
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