两个斑茅BC1无性系染色体核型及染色体遗传分析1.doc
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1、豆丁网精品论文两个斑茅无性系染色体核型及染色体遗传分析1邓祖湖 1,赖丽萍 2,林炜乐 2,符成 3,林彦铨 21 农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室,福州(350002)2 福建农林大学作物科学院,福州(350002)3 广州甘蔗糖业研究所,广州(510642)E-mail:摘要:本文对两个斑茅 BC1 后代,崖城 0121 和崖城 0136 进行 ITS 签定和染色体计 数与核型分析,以探讨斑茅后代的染色体遗传行为。研究结果表明,崖城 0121 的体细胞染色体核型公式为 2n104100m+4sm(4SAT),最长与最短染色体的长度比为 4.25,平均 臂比 1.35,染色体属 2
2、C 型,分子鉴定结合细胞学研究认为其为斑茅的真实后代,其染色体遗传为 n+n;崖城 0136 经 ITS 签定为真实杂种,其体细胞染色体核型公式为 2n132130m+2sm,最长与最短染色体的长度比为 3.94,平均臂比 1.27,染色体属 2B 型,结合其 性状的进展,推断亲本向其传递染色体可能以 2n+n 的方式进行。关键词:斑茅,甘蔗,ITS 鉴定,核型分析,染色体遗传行为甘蔗是我国优势农产品,为我国乃至世界最重要的糖料作物1。甘蔗一方面具有广泛的 种质血缘基础,目前的栽培甘蔗品种大都含有甘蔗属 35 个种的血缘,但同时由于甘蔗大 多数无性系不易开花,花期差异大,花粉量和花粉育性等开花
3、习性差异及配合力等原因影响, 致使在甘蔗杂交育种常规组合选配中,可使用的亲本材料少,由于长期近亲杂交,品种间的 遗传性逐渐趋于一致,从而限制了品种生产力的进一步提高2 。必须不断创新种质才能选 育出突破性新品种。.世界甘蔗育种发展趋势是通过扩大甘蔗种质基础,开发近缘属、种植物的利用来提高甘 蔗的产量、糖分和生活力。为扩大异质性,各国育种家不断进行了甘蔗种间、近缘属间和远 缘属间杂交,通过染色体数目分析推断,甘蔗远缘杂交存在2n+n、n+n、n+2n、2n+2n等多 种类型,并且n常常不是一倍体的原来数目,常有增减,即存在“不平衡杂种”3。斑茅(S.arundinaceum Retz)是甘蔗的近
4、缘属植物,具有生长旺盛、抗旱耐瘠、抗病虫性强、宿根性好、适应性广、生态竞争能力强等优良性状4-6。因此,斑茅的杂交利用越来越 受到国内外甘蔗育种界的重视,期望通过甘蔗与斑茅远缘杂交把斑茅的优异特性导入甘蔗 中,寻求甘蔗育种新的突破7-9。但,斑茅杂交利用尝试几十年,进展缓慢,至今尚未选到 经鉴定为斑茅真实杂种的可供生产或育种应用的品种或亲本材料10.11。其原因主要有:(1) 杂种鉴定难;(2)后代花粉育性低;( 3)杂交后代遗传机理不明,染色体(性状)的遗传与 分离规律不清。然而,由于甘蔗细胞的多倍性和异质性,染色体数目多、体积小等原因,使 得核型分析较难进行12.13,因而甘蔗细胞学研究进
5、展缓慢。为更了解甘蔗与斑茅杂交后代的染色体遗传行为,提高斑茅在甘蔗育种上的利用效 率。本文对两个斑茅 BC1 无性系崖城 0121 和崖城 0136 进行了染色体核型分析,旨在 了解甘蔗与斑茅杂交 BC1 代的染色体行为,以便为斑茅在甘蔗育种上的充分利用提供一定 的细胞学理论依据。1本课题得到国家自然科学基金(30671329)、教育部博士点基金(20050389003)和福建省自然科学基金(2006J0309)资助。通讯作者:林彦铨。Tel:0591-83789271, E-mail:1 材料与方法1.1 材料选取保育住福建农林大学甘蔗综合研究所资源圃,崖城96-40和栽培种CP84-119
6、8的后代 崖城0121和崖城0136为材料,其系谱图为:拔地拉海南斑茅 92-77崖城 96-40CP84-1198崖城 0121崖城 0136图 1 谱系图1.2 研究方法1.2.1 甘蔗斑茅 BC1 杂种真实性鉴定 根据农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室建立的已授权的发明专利“甘蔗斑茅杂种的 DNA 鉴定方法”,利用据 ITS 区保守序列设计的两对 ITS 区特异引物(EF1 和 ER1;EF2 和 ER2)对崖城 96-40 和 CP84-1198 的杂交后代崖城 0121 和崖城 0136 进行真实性 鉴定;PCR 扩增反应在 Eppendorf Mastercycler Gr
7、adient 扩增仪上进行,扩增程序为 95OC 预 变性 5 min,93OC 变性 50s,52OC 退火 20s,72OC 延伸 40s,共 30 个循环,最后 72 保温 5 min。1.2.2 染色体玻片制备1.2.2.1 适温诱根:在湿润 28OC 条件下,使带节茎段发根 2-3cm,斑茅用基部茎段促根。1.2.2.2 预处理:当根长 2-3cm 时,除去根冠,剪下根尖,立即投入饱和 -溴萘溶液中,在 暗室中进行室温处理 4 小时。1.2.2.3 固定:将预处理过的根尖置于甲醇冰乙酸(3:1)溶液中,在冰箱固定 12 小时以 上。1.2.2.4 酶解:固定过的根尖在蒸馏水中浸洗 5
8、-6 遍,然后置于 500u/ml 纤维素酶(东京化成 工业株式会社,25u/mg,)和 250u/ml(东京化成工业株式会社,2.5u/mg,)果胶酶的混合液 中,在 31OC 下酶解 4-6 小时(不同的材料或同一材料的不同大小的根尖酶解时间不同)。1.2.2.5后低渗:酶解后的根尖用蒸馏水浸洗 5-6 遍,然后置于蒸馏水中后低渗 30 分钟。1.2.2.6涂片:取一干净的玻片,夹几个根尖置于玻片上,滴一滴固定液,快速用镊子敲碎, 去掉大块残渣,涂均,在火焰上微烤,烘干。1.2.2.7染色:制好的片子在 PH 值为 6.87.0 的 Giemsa 染液中染色 30 分钟。1.2.3 染色体
9、计数及核型分析每个样品取 20 个完整细胞在 DIALUX 20EB 1000 倍高倍镜下进行染色体计数,选取分 散性好的细胞,通过 Pixera 与微机连接拍摄,之后测量其长度。在放大的图片上剪取染色 体,根据染色体的形态特征以及对测量得到的数据进行分析,进而进行同源配对,排成核型 图。核型分析按李懋学等14的标准经适当的修改后进行。核型分析有关参数按下列公式计算:某号染色体长度1)相对长度(100%)全部染色体总长度100长臂2)臂比短臂最长染色体3)染色体长度比最短染色体2 结果与分析2.1 甘蔗斑茅杂交后代 BC1 杂种真实性鉴定利用农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室建立的甘蔗
10、斑茅真实杂种鉴定技 术鉴定崖城 96-40 与商业栽培种 CP84-1198 回交的后代崖城 01-21 和崖城 0136。结果显示, 以 EF2 和 ER2(图 2),EF1 和 ER1(图 3)为引物,斑茅 9277、崖城 96-40 和崖城 01-36 都扩增出斑茅特有条带,而拔地拉和 CP84-1198 没有相应条带,说明崖城 0136 为甘蔗斑 茅的真实杂种,而崖城 0121 在以 EF1 和 ER1 为引物下扩增出特异条带,在 EF2 和 ER2 中没有扩增出条带,这点与郑雪芳的结果一致,该文中 115 号样品为崖城 0121,尚难断 定是否为斑茅的真实杂种15,需与其它方法结合来
11、初步判断为甘蔗斑茅的真实杂种,拟进 一步进行细胞学遗传分析。图 2 引物 EF2/ER2 扩增结果Fig2 Amplification patterns of the hybrid and backcross progeny from the cross of S. officinarum L. and E.arundinaceum using EF2ER2图 3 引物 EF1/ER1 扩增结果Fig3 Amplification patterns of the hybrid and backcross progeny from the cross of S. officinarum L. a
12、nd E.arundinaceum using EF1ER1注:M:dl2000 1:badila 2:海南 92-77 3、崖城 96-40 4、cp84-1198 5、崖城 01-21 6、崖城 01-36Note: M、dl2000 1、badila 2、Hainan92-77 3、Ya96-40 4、cp84-1198 5、Ya01-21 6、Ya01-362.2 甘蔗斑茅远缘杂交后代杂种细胞学分析2.2.1 崖城 0121崖城 01-21 的体细胞染色体数众数为 2n104(102106),绝对长度 1.265.54um, 其形态特征见图 8。表 1 列出的是崖城 01-21 的 5
13、2 对染色体的相对长度、臂比及类型。从 图 8、图 10 及表 1 可见,崖城 01-21 的染色体中,第 5 和 8 号染色体臂比介于 1.713.00, 为亚中部着丝点染色体(sm),其余 50 对染色体臂比 1.011.70,为中部着丝点染色体(m), 而且第 6 和 9 号染色体具随体。最长与最短染色体的长度比为 4.25,平均臂比 1.35,核型公 式为 2n104100m+4sm(4SAT),染色体属 2C 型,其染色体核型模式图可见图 10。2.2.2 崖城 0136崖城 01-36 的体细胞染色体众数为 2n132(128134),绝对长度 1.455.72um,其 形态特征见
14、图 9。表 2 列出的是崖城 01-21 的 66 对染色体的相对长度、臂比及类型。从图 9、 图 11 及表 2 可见,崖城 01-21 的染色体中,第 9 号染色体臂比介于 1.713.00,为亚中部着 丝点染色体(sm),其余 65 对染色体臂比 1.011.70,为中部着丝点染色体(m)。最长与最 短染色体的长度比为 3.94,平均臂比 1.27,核型公式为 2n132130m+2sm,,染色体属 2B 型,其染色体核型模式图可见图 11。表 1 崖城 01-21 的染色体核型参数Table 1 Parameters of chromosome in Ya01-21长臂long ram
15、短臂short arm总长totalarm ratio(long/short)3.252.235.481.462.951.914.861.542.581.674.251.542.541.604.141.592.801.183.982.372.181.593.771.372.231.393.621.602.441.113.552.201.981.563.541.272.061.353.411.532.081.303.381.601.771.493.261.191.701.463.161.161.951.173.121.671.551.503.051.031.551.473.021.051.551
16、.463.011.061.761.222.981.441.561.412.971.111.721.262.981.371.631.182.811.391.461.352.811.081.701.042.741.631.431.212.641.181.491.122.611.331.591.012.601.571.481.122.601.321.361.222.581.111.491.072.561.391.351.182.531.141.450.872.321.671.261.042.301.21染色体编号number相对长度 relative length %臂比类型type1m2m3m4m
17、5sm6SAT7m8sm9SAT10m11m12m13m14m15m16m17m18m19m20m21m22m23m24m25m26m27m28m29m30m31m32m331.370.922.291.50m341.261.022.281.24m351.181.042.221.13m361.280.932.211.38m371.120.932.051.20m381.160.872.031.33m391.070.942.011.14m401.050.911.961.15m411.040.871.911.20m420.960.931.891.03m431.040.791.831.32m441.01
18、0.811.821.25m450.960.841.801.14m460.990.791.781.25m471.040.741.781.41m481.010.751.761.35m490.890.761.651.17m500.840.751.591.12m510.890.591.481.51m520.730.561.291.30m染色体编号表 2 崖城 01-36 的的染色体核型参数Table 2 Parameters of chromosome in Ya01-36相对长度 relative length %臂比类型number长臂long ram短臂short arm总长totalarm r
19、atio(long/short)type13.382.345.721.44m23.292.255.541.46m32.812.495.301.13m42.741.664.401.65m52.561.754.311.46m62.311.854.161.25m72.331.824.151.28m82.081.954.031.07m92.731.294.022.12sm102.431.543.971.58m112.111.833.941.15m122.341.563.901.50m132.041.853.891.10m142.061.773.831.16m152.111.673.781.26m162
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- 两个 BC1 无性 染色体 核型 遗传 分析
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