乙草胺对玉米根际和非根际可培养微生物的影响.doc
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1、乙草胺对玉米根际和非根际可培养微生物的影响农业环境科学2009,28(9):19361941JournalofAgro-EnvironmentScience乙草胺对玉米根际和非根际可培养微生物的影响徐会娟,一,何红波,武叶叶,郭柏栋,张旭东,-,李丽君(1.中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁沈阳110016;2.中国科学院研究生院,北京100049;3.沈阳市规划设计研究院,辽宁沈阳110016;4.辽宁沈阳农田生态系统国家野外观测研究站,辽宁沈阳110016;5.中国地质调查局沈阳地质调查中心,辽宁沈阳110033)摘要:为探明土壤一植物系统中,田间施用量的乙草胺对玉米根际和非根际微生物数量
2、的影响,采用田间试验及室内测试方法,在玉米苗期不同阶段测定了土壤中微生物量碳的变化,并进一步用平板稀释培养法研究了玉米根际和非根际土壤中细菌和真菌数量的变化.结果表明,乙草胺施用对玉米根际和非根际的土壤微生物群落均具有一定影响.可培养的根际细菌和真菌均呈现先抑制后刺激的变化,但与真菌不同,细菌受到的抑制作用时间较短,刺激作用时间较长;而本体土壤中可培养细菌和真菌则主要受到抑制作用,但是抑制作用的强度和持续时间差别很大.乙草胺对根际土壤微生物量碳可产生一定刺激作用,但影响并不显着;由于乙草胺施用对非根际土壤细菌和真菌的影响不同步并存在群落结构的补偿作用,从而维持了非根际土壤总体微生物生物量碳的基
3、本稳定.关键词:乙草胺;降解;微生物群落;可培养微生物;根际中图分类号:S154.34文献标志码:A文章编号:16722043(2009)09193606EffectsofAcetochloronCulturableMicrobialCommunitiesinMaizeRhizosphereandNon-RhizosphereSoilXUHui-juan,HEHong-bo1,WUYe-ye,GUOBai-dong,ZHANGXu-dong4LILiun(1.InstituteofAppliedEcology,CAS,Shenyang110016,China;2.GraduateSchoolo
4、fCAS,Beijing100049,China;3.ShenyangUrbanPlanningDesignandResearchInstitute,Shenyang110016,China;4.NationalFieldObservationandResearchStationofShenyangAgroecosystem,Shenyang110016,China;5.ShenyangCenter,ChinaGeologicalSurvey,Shenyang110033,China)Abstract:Acetochlorisakindofimportantpreemergenceherbic
5、ideandhasbeenwidelyusedforthecontrolofannualgrassesandbroadleafweedsinrowcropssuchascorn,soybeanandsorghum.Asbeinglabeledasaprobablehumancarcinogen,theintensiveuseofacetochlorisconsideredtobeseriousthreattohumanhealthandenvironmentalsafety.Microorganismscanrespondrapidlytochangesinsoilenvironments,r
6、egardlessofnutrientorhazardmaterialinput.Inthispaper,theeffectsofagriculturallyrelevantapplicationrateofacetochloroncuhurablemicrobialcommunitiesinmaizerhizosphereandnon-rhizospheresoilsduringdifferentstagesofmaizeseedlingswereinvestigated.Theresultsshowedthattheresponseofdifferentmicrobialcommuniti
7、esinrhizosphereandnonrhizospheresoilstoacetochlorwastimedependent.Thecuhurablebacteriainbothrhizosphereandnonrhizospheresoilswereinhibitedinitiallybutthoseinrhizospherewerestimulatedsignificantlyafterward.Theculturablefungiinrhizospheresoilwereinhibitedtill30daysafteracetochlorapplicationandthenwere
8、reactivated;however,fungiinnonrhizospheresoilwerekeptinhibitedwithin24daysapplication.Thesoilmicrobialbiomassinrhizospherewasstimulatedslightlybyacetochlorapplicationwhilethatinnon-rhizosphereexhibitednosignificantdifferencebetweenthetwotreatments.Itcouldbereckonedthattheasynchronouseffectofacetochl
9、oronbacteriaandfungiaswellasthecompensatoryshiftofcommu-nitystructurewasmainlycontributedtotheinsignificantchangeofsoilmicrobialbiomasscarboninnonrhizoshpheresoil.Keywords:acetochlor;degradation;microbialcommunity;cuhurablebacteriaandfungi;rhizosphere乙草胺,英文通用名为acetochlor,化学名称为收稿日期:20090113基金项目:国家重点基
10、础研究发展计划(973)计划(2005CB121104);国家科技支撑计划(2OO7BAD89B02)作者简介:徐会娟(1983一),女,山东菏泽人,在读硕士,主要从事乙草胺的生态安全性研究.Email:xuhuijuan1028163.coin通讯作者:何红波Email:hehongboiae.ac.ca2一氯一N一(乙氧基甲基)一N一(2一乙基一6一甲基苯基)乙酰胺,属酰胺类芽前除草剂,被广泛地用于大豆,花生,玉米,棉花等作物防除一年生禾本科杂草和部分阔叶杂草【.因其原药对大鼠,小鼠有致肿瘤作用,美国环保局将其定为B一2类致癌物.研究已表明,喷施的除草剂仅有不到1%作用于目标杂草,而99%
11、以上第28卷第9期农业环境科学1937分散在周围环境中2-3.随着施用面积不断扩大,农田系统中的乙草胺可能会对作物,土壤5-61和水体71等造成污染,进而给人类生活健康带来威胁.因此,研究乙草胺的降解残留动态以及对土壤生态环境的影响具有重要的现实意义.微生物是土壤生态系统的重要组成部分,土壤微生物生物量虽然仅占土壤有机质的l%4%,但却是土壤有机质中活性最高的部分,无论在生命元素的生物地球化学循环,还是在外来污染物转化降解过程中均具有重要地位.同时,微生物对土壤环境变化的反应十分灵敏.因而,在有效分解土壤中的有机污染物的同时,微生物的种类和数量10-11】,群落结构12-13J不:可避免地会受
12、到一定影响.在土壤一作物体系中,由于植物根系及其分泌物的存在,形成了独特的根际微环境,使根际土壤中的微生物数量和活性与非根际土壤显着不同,从而加快了环境中有机污染物降解转化.然而,有关污染物如乙草胺降解过程中根际微生物群落结构变化的研究尚未开展.从方法学上来看,土壤微生物量,土壤诱导呼吸等指标可反映总体微生物活性,但无法检测微生物群落组成的细微变化,然而这种变化在实现污染物降解等功能上非常重要15-16.近年来发展的分子生物学方法已被越来越多地应用于描述微生物群落结构,但是由于微生物过程代谢和生物化学途径的复杂性,无法找到理想的标识物作为唯一标准用以衡量微生物群落的变化.研究表明,尽管可培养微
13、生物数量仅占土壤总微生物量的0.1%1O%ll81,但在低浓度污染物存在时,利用培养法能够更灵敏地反映不同微生物群落的响应1910因而,本文利用稀释平板培养法研究了田间用量乙草胺的施用对玉米根际和非根际细菌和真菌数量的影响,为评价农田生态系统乙草胺潜在风险提供依据.1材料与方法1.1试验材料与设计田间试验于2007年在国家农田生态系统沈阳野外科学观测研究站进行(41.31N,123.341E),供试土壤为潮棕壤.种植玉米为富友一号,由三亚种子公司提供.乙草胺50%乳油购自大连瑞泽农药股份有限公司,喷施量为3000mL?hm-z(1.28mg乙草胺?kg土).另设不喷施乙草胺地块为对照,两个处理
14、均为3次重复.分别在喷施乙草胺后第15,19,24,33,40d采样.本体(非根际)土用土钻采集015cm的表层土壤,7点混合;根际土采用抖根法获得.取部分新鲜土壤样品测定微生物量,其他土壤样品风干过筛(<2mm)测定乙草胺残留.1.2乙草胺在土壤中残留分析方法乙草胺残留测定与计算采用冯慧敏等建立的内标法进行.1.2.1主要仪器与试剂Agilent6890气相色谱仪(带电子捕获检测器ECD);NN型旋转蒸发仪;HZQC空气浴振荡器;KQ一500DE型数控超声波清洗器及其他常规玻璃仪器.丙酮(分析纯),乙酸乙酯(分析纯),石油醚(分析纯,重蒸后使用),无水硫酸钠(分析纯),氯化钠(分析纯)
15、,中性氧化铝(100200目,层析用,105干燥2h,于干燥器中冷却至室温,加8%蒸馏水减活),邻苯二甲酸二正戊酯(色谱纯,内标),乙草胺标准品(含量>99.0%),正己烷(色谱纯).1.2.2预处理方法样品前处理具体步骤如下:提取.称取20g风干土(同时测定土壤水分)置于250mL具塞三角瓶中,加人2mL一定浓度的乙草胺和内标,10mL蒸馏水和50mL丙酮,振荡30min,再用超声波提取5min,用布氏漏斗抽滤,残渣和接收瓶用30mL丙酮分3次洗涤,将滤液转移到250mL分液漏斗中.萃取.在分液漏斗中加人8%NaC1水溶液50mL,然后用石油醚萃取3次,每次用量30mL,石油醚层通过无
16、水硫酸钠层干燥过滤,滤液在旋转蒸发仪上45浓缩至少量.净化.用石油醚预淋后将浓缩样品用30mL石油醚:乙酸乙酯为7:3(V:V)混合液溶解(分几次洗涤),淋洗转入层析柱中,收集淋洗液,再次浓缩蒸干后,用2mL正己烷定容,转入色谱瓶待测.同时按上述处理方法做土壤空白和试剂空白.1.2.3色谱测定色谱测定条件:载气,高纯氮气(纯度99.99%),载气流速1.0mL?min,进样口温度220oC,分流比10:1,ECD检测器温度300,进样量1L.色谱柱升温程序:120保留lmin,以30?rain升到180,然后以3?min升到205(保留5min),再以2O?min升至0270(保留2rain)
17、.1.2.4土壤中乙草胺残留计算cC式中:G为添加的已知内标物浓度;,Ax分别为色谱仪测定得到内标标准样品,乙草胺样品峰面积;Rs为相对校正因子.徐会娟等:乙草胺对玉米根际和非根际可培养微生物的影响2009年9月1_3微生物量的测定和计算微生物量采用氯仿熏蒸浸提【21一总有机碳分析仪(TOC,MultiC/N3000,Germany)lJ定.计算公式:I)(C)=Ec(51)式中:I)(C)为微生物量碳质量分数,mg?kg;Ec为熏蒸土样有机碳量与未熏蒸土样有机碳量之差,mg?kg;为氯仿熏蒸杀死的微生物体中的碳被浸提出来的比例,取0.3821.1.4微生物计数按稀释平板培养法培养微生物.细菌
18、用牛肉膏蛋白胨培养基培养,真菌用马丁氏培养基.样品稀释液的制备:准确称取待测土样10g,放人装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中,用手或置摇床上振荡20min,使微生物细胞分散,静置2030s,即成10稀释液;连续稀释,制成10,1O,1O,10,10,10等一系列稀释菌液.根际土壤细菌和真菌分别选择10,l0,lO和10,10,l03个稀释度,非根际土壤细菌和真菌分别选择10_4,10_5,1O_6和10_2,l0_3,1O3个稀释度.接种:采用涂抹平板法,是先将培养基熔化后趁热倒人无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上
19、(每个编号设3个重复).再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀.将涂抹好的平板平放于桌上2O30min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,细菌和真菌分别在28.c恒温培养箱培养48和72h后计数.1.5数据统计与分析试验数据采用Microsoftexcel和SPSS13.0统计分析软件进行分析.2结果与分析2.1乙草胺在土壤中的残留动态以及对根际和非根际土壤微生物量碳的影响无论是根际还是非根际土壤中,残留(可检测)乙草胺浓度均随乙草胺施人时间的增加而显着降低.乙草胺施人15d后,根际和非根际土壤中乙草胺残留占施人量的16.39%和29.70%,40d后取样时,根际和非根际土壤中乙草胺残留分别为
20、542.7和865.3g?,分别仅占初始施人量的4.2%和6.8%,说明乙草胺在土壤中降解快,残留量低,且在根际土壤中乙草胺的降解程度得到进一步提高(图1).乙草胺在根际土壤中残留较低与根际的复杂环境和丰富的微生物有关.在此期间,根际和非根际土壤中的乙草胺在取样前期(约20d)降解速率均显着高于取样后期,残留动态符合一级动力学方程,相关系数分别为0.9654和0.9762.乙草胺在土壤中的残留具有时间短,数量低的特点,这和乙草胺的半衰期较短密切相关.咖圈餐图中施土和未施土分别代表喷施乙草胺和未喷施乙草胺的本体土,施根和未施根分别代表喷施和未喷施乙草胺的根际土,下图同.图1根际和非根际土壤中乙草
21、胺残留量随时间的变化Figure1Residueofacetochlorinrhizosphereandnonrhizospheresoil土壤微生物量碳的动态受到玉米的生长,乙草胺的施人及环境因素的综合影响.如图2所示,乙草胺对非根际土壤微生物量的影响因取样时间而异,表现出或促进或抑制作用,但差异除第15d外均不显着(P<0.05).正如毒理试验所表明的,低浓度(田间推荐量)乙草胺毒性较小,不至于导致土壤微生物量和土壤呼吸等表征土壤总体微生物活性的指标发生显着变化241.由于玉米根系分泌物能为微生物提供能源物质,加上根际土壤的物理和化学性质与非根际土壤不同1253,根际土壤微生物量碳显
22、着高于非根际土壤,根际效应达2.36_3倍.乙草胺施用使玉米根际微生物量碳数值进一步增加,增加幅度在3.14%一50.96%之间,除第24d外,处理与对照之间差异显着(P<O.05),表明乙草胺施用对根际微生物的活性存在一定刺激作用.根际微生物量碳受到的刺激作用随着乙草胺的降解,在第40d恢复到正常水平.由于受到玉米生长和乙草胺在土壤中的吸附一解吸过程的影响261,玉米根际和非根际土壤微生物量的变化与乙草胺的残留量并没有明显的相关性,相关系.窨,一一0蛊一一兰0一I0第28卷第9期农业环境科学催蝴151924334O时间Time/d图2乙草胺处理后根际和非根际微生物量碳随时间的变化规律F
23、igure2Temporalpatternofmicrobialbiomasscarboninrhizosphereandnonrhizospheresoilwithorwithoutacetochlorapplication数r分别为一0.138和0.566.但是有关研究表明,微生物降解作用是导致土壤中残留乙草胺浓度下降的重要原因271.在相同外界环境条件(40d除外)下,各取样时间乙草胺在根际土壤中的残留量显着低于非根际土壤,说明微生物作用是乙草胺在根际降解程度提高的重要原因,同时其自身活性也不可避免地受到了一定程度的影响.由于土壤微生物生物量是复杂的微生物群落功能与活性的综合反映,利用选
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