白血病 K562ADM 耐药细胞中白血病干细胞及其耐药蛋白的.doc
《白血病 K562ADM 耐药细胞中白血病干细胞及其耐药蛋白的.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《白血病 K562ADM 耐药细胞中白血病干细胞及其耐药蛋白的.doc(8页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、精品论文白血病 K562/ADM 耐药细胞中白血病干细胞及其耐药蛋白的表达1易娟, 孙静, 陈静, 魏虎来*兰州大学基础医学院 医学实验中心,甘肃省新药临床前研究重点实验室(730000)E-mail:摘 要目的:比较观察白血病药物敏感和耐受细胞中白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)及其生物学特性。方法:以白血病多药耐药株 K562/ADM 细胞及其药物敏感的亲本 K562 细胞为模型,采用流式细胞术检测干细胞免疫标志,以及耐药蛋白 P- 糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protei
2、n,BCRP)的表达; 甲基纤维素集落形成法检测细胞的自我更新和增殖能力。结果:K562/ADM 细胞中 CD34+、 CD123+和 CD34+CD38细胞含量均显著高于 K562 细胞,CD34+CD38CD123+(LSC)细胞 含量是 K562 细胞的 4 倍;K562/ADM 细胞高表达 P-gp 和 BCRP,其中 CD34+细胞和 CD123+ 细胞表达 BCRP1 者显著高于 K562 细胞;约 4%的 K562/ADM 细胞共表达 P-gp 和 BCRP, 其比例与其 LSC 含量接近;K562/ADM 细胞集落形成能力较 K562 细胞为强,K562/ADM 细胞集落形成率
3、是 K562 细胞的 4 倍。结论:白血病耐药细胞群中存在较高含量的 LSC,耐 药性 LSC 是白血病治疗抗性的根源。关键词:白血病干细胞,多药耐药性,P-糖蛋白,乳腺癌耐药蛋白,集落形成 中图法分类号:R73.30 引言药物耐受和放射抵抗是影响白血病及其它实体肿瘤疗效、复发、转移的关键因素。白 血病干细胞(leukemia stem cells, LSC)被认为来源于正常造血干细胞或由处在某个分化阶 段的造血细胞转化而来,具有正常造血干细胞的部分免疫标志和特性,如自我更新能力和无 限增殖能力,同时对抗癌药物和放射线耐受,且有极强的 DNA 修复和凋亡抑制机制1-3。近 年来,白血病(肿瘤)
4、干细胞与白血病(肿瘤)治疗抗性的关系逐渐引起了关注4,5。本文 以白血病多药耐药株 K562/ADM 细胞及其药物敏感的亲本 K562 细胞为模型,比较观察药物 敏感和耐受白血病细胞中 LSC 含量及其生物学特性。作者简介:易 娟,1978 年生,女,硕士研究生。E-mail: 通讯作者:魏虎来,Tel: 0931-8915082; Fax: 0931-8915082; 81 材料与方法1.1 材 料阿霉素(Adriamycin, ADM)为日本明治制药公司产品;甲基纤维素(4000CPS)购自 美国 AMRESCO 公司;PE 标记的羊抗鼠 IgG2a 由 Caltag 公司出品;抗 P-g
5、p(MRK16)为 Kamiya Biomedical 公司产品;PEcy5 标记的鼠抗人 CD34 抗体、FITC 标记的鼠抗人 CD38 抗体购自 Caltag 公司;PE 标记的鼠抗人 CD123 抗体购自 eBioscience 公司;FITC 标记的鼠 抗人 BCRP1 抗体购自 Millipore 公司;同型对照 PE 标记的鼠抗人 IgG1 免疫球蛋白、FITC 标记的鼠抗人 IgG1 免疫球蛋白和 PEcy5 标记的鼠抗人 IgG1 为 Caltag 公司产品。1.2 靶细胞和细胞培养K562 细胞和 K562/ADM 细胞由兰州大学医学实验中心保存。细胞接种于含 15%新生
6、牛血清(杭州四季青公司)的 RPMI 1640 培养液(美国 Gibco BRL 公司)中,置 37、5%CO2 和全湿条件下培养,取对数生长期细胞用于实验。1.3 细胞表面标志检测收集对数生长期的 K562 细胞和 K562/ADM 细胞,PBS 洗涤,调整细胞浓度 1x106 个/ml, 对照管加入 PE 标记、FITC 标记和 PEcy5 标记的鼠抗人 IgG1;检测管加入 PEcy5-CD34 、 FITC -CD38 和 PE - CD123,室温避光孵育 20 分钟, PBS 洗涤,流式细胞仪(FCM, Beckman-Coulter Epics XL)检测,实验重复三次。1.4
7、P-gp 和 BCRP 表达测定分别收集 K562 细胞和 K562/ADM 细胞,PBS 洗涤,调整细胞浓度 1x106 个/ml,每对 照管加入 PE 标记和 FITC 标记的鼠抗人 IgG1;检测管加入 MRK-16(一抗)室温孵育,洗 涤,再加 PE 标记的羊抗鼠 IgG2a(二抗),室温避光孵育 20min 后 PBS 洗涤,再加入 FITC 标记的鼠抗人 BCRP1 抗体,孵育 30 分钟,PBS 洗涤,FCM 检测,实验重复三次。测试样品中分别加入 PEcy5-CD34 和 FITC-BCRP1 以及 PE- CD123 和 FITC-BCRP1,分 别检测 CD34+和 CD1
8、23+细胞 BCRP1 的表达,相应鼠抗人 IgG1 为同型对照。1.4 甲基纤维素集落形成分析根据文献6改进。取对数生长期的 K562 细胞和 K562/ADM 细胞,按 1103 细胞/ml 接 种于含 20%小牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、5mol/L -巯基乙醇和 0.9%甲基纤维素的半 固体培养基中,置 37C、5%CO2 和饱和湿度条件下分别培养 5 天和 10 天。倒置显微镜(Olympus IX81)下计数集落数,以大于 40 个细胞的细胞团为 1 个集落。实验重复三次。1.5 统计学分析数据结果用 x s 表示。采用 SPSS10.0 统计软件进行统计分析,组间均数
9、差异性采用 t检验。2 结 果2.1 药物敏感和耐药性白血病细胞中的白血病干细胞含量流式细胞术分析药物敏感的 K562 细胞和多药耐药的 K562/ADM 细胞的相关表面标志, 发现 K562/ADM 细胞中 CD34+、CD123+和 CD34+CD38细胞含量均显著高于 K562 细胞(P0.01),白血病干细胞(CD34+CD38CD123+)含量是 K562 细胞的 4 倍(表 1)。表 1 K562 和 K562/ADM 细胞中的白血病干细胞含量(%, x s)细 胞CD34+CD123+CD34+CD123+CD34CD38CD34+CD38CD34+CD38CD123+K5624
10、.370.614.571.122.330.1593.932.113.930.671.270.17K562/ADM12.131.20b13.80.50b8.401.41b85.432.2712.470.91b5.230.21an=3,与 K562 比较:a P0.05, b P0.012.2 药物敏感和耐药性白血病细胞 P-gp 及 BCRP1 的表达表 2 所示,K562 细胞几乎不表达 P-gp 和 BCRP1,而 K562/ADM 细胞几乎 100%表达 P-gp 和约 10%表达 BCRP1,约 4%的 K562/ADM 细胞共表达 P-gp 和 BCRP1,与 LSC 含量 接近;结合
11、细胞表面标志分析,K562/ADM 细胞中 CD34+细胞和 CD123+细胞表达 BCRP1 者显著高于 K562 细胞,且 BCRP1 更多表达在 CD34细胞上(表 3,P0.01)。表 2 K562 和 K562/ADM 细胞中 ABC 转运蛋白 P-gp 及 BCRP 的表达(%, x s)细 胞P-gp+BCRP+P-gp+ BCRPP-gp+BCRP+K562K562/ADM1.810.5598.571.22b2.650.219.940.61b1.760.5295.000.78b0.050.033.570.46bn=3,与 K562 比较:a P0.05, b P0.01表 3
12、白血病干细胞样细胞 BCRP 的表达(%, x s)细 胞CD34+BCRP+CD34BCRP+CD123+BCRP+CD123BCRP+K562K562/ADM1.400.235.771.14a2.230.4913.131.37b1.590.145.500.69a2.970.46.340.52an=3,与 K562 比较:a P0.05, b P0.012.2 K562 细胞和 K562/ADM 细胞集落形成能力采用甲基纤维素为支持物的集落形成法(colony-forming assay )检测 K562 细胞和 K562/ADM 细胞的自我更新和增殖能力,以培养 5 天形成的集落为早期集落
13、、培养 10 天以 上为晚期集落。K562/ADM 细胞集落形成能力较 K562 细胞为强(表 4),早期集落形成数两 者差异较小,但 K562/ADM 细胞晚期集落形成率是 K562 细胞的 4 倍,K562 细胞和 K562/ADM 细胞晚期集落形成率的比值相当于其 LSC 比值(表 1,表 4)。分析集落形态, 早期集落大而疏松,晚期集落较小、组成细胞致密;培养 10 天以上,早期集落细胞多数已 死亡崩解(图 1)。早期集落一般由较“成熟”的分化晚阶段白血病细胞形成,而晚期集落 则主要由白血病干/祖细胞形成。表 4K562 和 K562/ADM 细胞的集落形成率(%, x s)细 胞早期
14、集落(5d)晚期集落(10d)K562K562/ADM6.970.539.271.001.800.607.500.55n=3,与 K562 比较:a P0.05, b P0.01K562K562/ADM早期集落晚期集落图 1K562 细胞和 K562/ADM 细胞集落形态(20)3 讨 论白血病(肿瘤)细胞对抗癌药物和放射线抵抗是临床白血病(肿瘤)治疗失败的主要原 因之一。白血病细胞耐药性的发生机制复杂,目前认为 ABC 转运蛋白超表达和凋亡途径受 抑是最主要的机制7,8。近年来学者注意到白血病(肿瘤)干细胞与多药耐药性和放射抵抗 密切相关,但对两者关系的研究工作少见。肿瘤(白血病)干细胞尽管
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 白血病 K562ADM 耐药细胞中白血病干细胞及其耐药蛋白的 耐药 细胞 干细胞 及其 蛋白
链接地址:https://www.31doc.com/p-3626003.html