氟对小胶质细胞过度产生活性氧自由基作.doc
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1、精品论文氟对小胶质细胞过度产生活性氧自由基作用的研究颜凌,刘子酉,王菲,刘盛男,颜南,席淑华5(中国医科大学公共卫生学院地球化学性疾病研究室,沈阳 110001) 摘要:目的: 观察氟作用下小胶质细胞氧化应激状况,为进一步研究氟致中枢神经系统损 伤机制提供实验依据。方法:用 1、10 和 50mg/L 的 NaF 处理 BV-2 小胶质细胞 24h 后,检测 细胞内活性氧(ROS)、超氧阴离子自由基(O2-)和硝基酪氨酸(NT)含量。结果:BV-2 小胶质细胞细胞染毒 24h 后,50mg/L NaF 处理的细胞内 ROS 含量显著高于对照组(p0.01);101、10 和 50 mg/L N
2、aF 染毒组细胞内 O2-含量均显著高于对照组(p0.05);10 和 50 mg/L NaF 处理的细胞内 NT 也显著高于对照组,三种活性氧自由基产物的含量均与染氟浓度呈显著地 正相关关系。结论:氟能激活小胶质细胞,使其产生较多的活性氧自由基,可能在氟所致的 中枢神经系统损伤中起一定的作用。关键词:关氟;小胶质细胞;ROS;O2- ;NT15The Study on Generation of Reactive Oxygen and Free radicals in Fluoride-Treated BV-2 Microgla CellsYan Ling, Liu Ziyou, Wang
3、Fei, Liu Shengnan, Yan Nan, Xi Shuhua(School of Public Health,China Medical University, ShenYang 110001)20Abstract: Objective: Observing oxidative stress of BV-2 microglia after treated by fluoride.Methods: BV-2 microglia cells were treated with 1, 10 and 50 mg/L NaF for 24h, and intracellularROS, O
4、2- and nitrotyrosine (NT ) were measured. Results: Contents of ROS and O2- increased inNaF-treated cells as compared with control cells, NT concentrations also increased significantly in10 and 50 mg/L NaF-treated cells compared with the control cells. The contents of intracellular25ROS, O2- and NT s
5、ignificantly increased with fluoride concentrations in a dose-dependent manner. Conclusion:Fluoride could activate microglia and induce microglia to produce more ROSand free radicals, which possibly resulted in central nervous system damage.Keywords: fluoride; microglia; ROS; O2-; NT300引言氟(F)是反应活性极强
6、的负电性元素,在自然界中广泛分布,是生物体必需的微量元 素之一。然而,世界上有 50 多个国家和地区,由于岩石土壤中氟含量过高,导致地方性氟 中毒的发生。氟中毒除了引起氟斑牙和氟骨症外,一些氟中毒患者常伴有神经系统症状,表 现为头痛、头晕、记忆力减退等中枢神经系统功能障碍症状。目前研究较多的是慢性氟中毒35引起的智力改变,认为高氟摄入与儿童智商呈显著负相关1,2。由于氟的反应活性极强,可 直接攻击氧,干扰氧代谢,影响抗氧化酶的活性,导致活性氧、自由基增多,引起细胞损伤。 研究显示,过量氟摄入的大鼠脑组 ROS、自由基明显增高,抗氧化水平下降3,4。小胶质细 胞是脑组织中的免疫细胞,一些内外因素
7、均可使其激活,活化后的小胶质细胞可通过NADPH 氧化酶和诱导性一氧化氮合酶(iNOS)产生大量的 ROS,是脑组织活性氧和活性氮的来源基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(编号 20112104110021)作者简介:颜凌,(1987-),女,硕士研究生,地方性氟中毒。通信联系人:席淑华,(1964-),女,教授,地方性氟、砷中毒。E-mail: - 5 -405-7。因此,小胶质细胞活化后,通过诱导神经元氧化应激而产生神经毒性作用。来源于 NADPH 氧化酶的 O2-能与 iNOS 催化产生的 NO 反应生成过氧亚硝酸阴离子(ONOO- ), ONOO-能与生物大分子结合引起
8、DNA 断裂和脂质过氧化。硝基酪氨酸(NT)就是 ONOO- 与蛋白结合的产物,可作为氧化损伤的标志物。本研究以小鼠小胶质细胞(BV-2 细胞)为 受试对象,观察氟对小胶质细胞氧化应激的作用,为进一步揭示氟对神经系统损伤的机制提45供依据。1材料与方法1.1 主要仪器及试剂NaF,上海生工生物工程有限公司;DMEM 高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶,HyClone 生物公司生产; DMSO,Sigma 公司;2,7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)和二50氢乙啡腚(DHE),碧云天生物技术研究所。超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;CO2 恒温培养箱,荷兰 Heraeus 公司;
9、倒置显微镜,Nikon 公司;流式细胞仪,FACScan; SHHW2-1Cr 型恒温水浴箱,北京长安科学仪器厂;3K18 型低速离心机,Sigma 公司;Sunrse508I 型自动酶标分析仪,瑞士 TECAN 公司。1.2 小胶质细胞的培养与染毒55小鼠小胶质细胞(BV-2)由中国协和医科大学基础医学细胞中心提供。BV-2 培养在含10%的胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中,放置于 37的含 5%CO2 细胞培养箱中增殖生长。 取对数生长期,生长良好的 BV-2 细胞,分别用浓度为 1、10、50mg/L 的氟化钠染毒 24h 后, 进行各项指标检测。1.3 细胞内 ROS 的相对含量检测
10、60细胞以 4104 个/ml 的密度接种于 6 孔板,2.5 ml/孔。设一不加 DCFH-DA 探针的孔为 阴性对照。放入 CO2 细胞培养箱中继续培养 23d 后,加入浓度为 0、1、10、50mg/L 的氟 化钠,染毒 24h,温 PBS 洗两次后加入 1ml 20mM DCFH-DA 工作液/孔,继续孵育 30min。 胰酶消化后加培养液离心取细胞沉淀,加入 1ml PBS 悬起细胞。使用 488nm 激发波长,525nm 发射波长检测刺激后的荧光强度。每次计数 10000 个细胞,用 Cell Quest 软件进行分析,以65DCF 的平均荧光强度表示 ROS 生成量。最终实验数据
11、以实验组的平均荧光强度与对照组的 平均荧光强度的相对比值(相对荧光强度)表示。1.4 细胞内 O2-的相对含量检测细胞以 4104 个/ml 的密度接种于 6 孔板,2.5 ml/孔。放入 CO2 细胞培养箱中继续培养23d 后,加入浓度为 0、1、10、50mg/L 的氟化钠,染毒 24h,温 PBS 洗两次后加入 1ml 5M70DHE 工作液/孔,继续 37孵育 30min。胰酶消化后加培养液离心取细胞沉淀,加入 1ml PBS 悬起细胞。使用 300nm 激发波长,610nm 发射波长检测刺激后的荧光强度。最终实验数据 以实验组的平均荧光强度与对照组的平均荧光强度的相对比值(相对荧光强
12、度)表示。1.5 细胞内硝基酪氨酸(NT)水平检测0、1、10、50mg/L 氟化钠处理的细胞提取物加入到 96 孔酶标板(包被有偶联抗原),75按照 ELISA 试剂盒说明书提供的操作步骤进行实验,设定酶标仪于 450nm 处(用双波长450/630nm 检测,在 5min 内读完数据),测定每孔 OD 值。绘制标准曲线,以标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数,即为样本中硝基酪氨酸的实际浓度。1.6 统计学分析用 SPSS 13.0 for Windows 软件进行数据统计分析。采用单因素方差分析(ANOVA)80进行组间比较,组间两两比较采用 LSD 检验,以 P0.05
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- 胶质 细胞 过度 产生 活性氧 自由基
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