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1、精品论文蒺藜苜蓿种子产量相关性状的遗传分析1雷艳芳 1,魏臻武 2,杨占花 1,盖钧镒 3,王仪明 11.甘肃农业大学草业学院,兰州(730070)2.扬州大学动物科学与技术学院,扬州(225009)3.南京农业大学国家大豆改良中心,南京(210095)E-mail: zhenwu_摘要:通过调查蒺藜苜蓿种子产量相关性状,解析蒺藜苜蓿种子产量构成因素。结果表明,除了千粒重和每荚种子数,单株种子产量及其它构成因素的变异较大(P0.05)。枝条伸展长 度与单株种子产量相关性最大,每荚种子数与单株种子产量相关性最小,其它性状与单株种 子产量均呈正相关。通过系统聚类法分析结果显示,参试蒺藜苜蓿种质可分
2、为 3 个类群。筛 选 6 份来自不同类群,种子产量特性差异大的蒺藜苜蓿种质作为杂交亲本。利用 22 对 EST-SSR、4 对 SSR 和 4 对 SRAP 多态性较高的引物,检测亲本种质的多态性发现 6 份亲本 多态性差异明显。蒺藜苜蓿 A20A17 组合的 RILs 群体种子产量性状的最佳遗传模型是两对 加性-上位性主基因模型。该组合群体种子产量遗传以主基因为主,多基因遗传率较低,第 二对主基因的加性效应值高于第一对主基因的加性效应值。关键词:蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn);种子产量;聚类分析;主基因+多基因遗传 分析;EST-SSR标记;SRAP标记研
3、究种子产量及其构成因素是苜蓿生产和育种的重要内容。苜蓿种子产量的生物学构成 因素很多,主要有单位面积的生殖枝数、每生殖枝花序数、每花序小花数、每花序小荚数、 每小荚种子数和种子千粒重等1。吴素琴等(2003)调查紫花苜蓿开花数和每荚种子数,发现 苜蓿种子产量的构成因素复杂,易受环境影响2。李世雄等(2003)研究 28 个苜蓿品种种子产 量性状的遗传多样性3。王显国等(2005)研究刈割对紫花苜蓿种子产量的影响,发现未刈割 处理的种子产量最高4。姜华等(2008)研究了苜蓿生殖生物学特性5。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn)已作为豆科模式植物,通过比较生物学和比较
4、基因组学途径,探索苜蓿种 子产量相关性状的遗传规律6。Wang(2005)研究了蒺藜苜蓿种子胚和胚乳的组织分化及种皮 和荚果的特性7。Le Signor(2005)研究来自不同生态型或不同的地理起源的蒺藜苜蓿品种种 子蛋白质含量的遗传变异8。研究蒺藜苜蓿种子产量构成因素及其遗传特性,利用蒺藜苜蓿 基因组学信息与苜蓿种子产量相关性状进行比较。对蒺藜苜蓿重要农艺性状的基因进行数量 性状基因座(QTLs)定位,将有利于克服苜蓿育种研究领域中的困难,为苜蓿重要农艺性状的 研究和分子标记辅助育种(MAS)工作建立重要的技术平台。分子标记技术作为重要工具已应用于牧草遗传和育种研究中。Brummer 等(1
5、993)、李拥 军等(1999)、魏臻武等(2002,2004,2007)、Jennifer 等(2007)利用限制性片段长度多态性 (RFLP)、随机扩增多态性 DNA (RAPD)、微卫星(SSR)、相关序列扩增多态性(SRAP)等分子 标记研究苜蓿遗传多样性914。快速增长的表达序列标签(EST)数据为建立和筛选 SSR 标记 提供了有效途径16。Ellwood 等(2006)利用 SSR 标记对蒺藜苜蓿核心种质进行了遗传多样性 研究17。张丽芳等(2007)优化蒺藜苜蓿 SSR 体系并对一年生苜蓿种质的遗传多样性进行了聚 类分析20。魏臻武(2006)综述了蒺藜苜蓿基因组学的研究进展2
6、1。蒺藜苜蓿基因组研究将推 动豆科牧草分子育种和新基因的发现,促进豆科牧草遗传研究和育种工作。盖钧镒等(2003)提出的主基因+多基因遗传分析方法把控制数量性状效应大的基因作为 主基因,把效应小的基因作为多基因,用以检测多基因效应并估计相应的遗传参数22。该1本课题得到国家自然科学基金(30671486)、甘肃省教育厅科学技术研究项目、江苏省博士后基金的资助。- 9 -方法能够克服很多作物难以得到近等基因系的限制,是一种实用的基因标记定位的方法,已在大豆、水稻等作物上广泛应用22,23。在牧草遗传育种中的应用目前尚未见报道。 本研究通过田间试验调查参试蒺藜苜蓿种质的种子产量相关性状,解析蒺藜苜
7、蓿种子产量性状的特性和构成因素。从 NCBI 数据库中搜索相关引物信息,利用分子标记检测不同蒺 藜苜蓿种质的多态性,进行遗传分析,为筛选不同蒺藜苜蓿遗传作图群体的亲本组合,构建 相关性状的作图群体,进行种子产量相关性状的 QTLs 定位奠定基础。同时,应用主基因+ 多基因数量性状分离分析模型对蒺藜苜蓿重组自交系(RILs)群体种子产量性状的基因效应 进行分析,为苜蓿的遗传育种研究提供相关依据。1. 材料与方法1.1 供试材料参试蒺藜苜蓿种质材料(表1)于2007年10月18日种植于南京农业大学江浦试验站,试验 采用随机区组设计,3次重复,单行条播,行距0.7m,小区面积10m2。同时,所有材料
8、进行 穴播,3次重复,穴距0.7m。蒺藜苜蓿RILs群体及其亲本A20和A17于2008年3月7日种植于扬 州大学实验牧场,单行条播,行距0.8m。表 1 参试蒺藜苜蓿种质的名称与来源Table1 Name and origin of Medicago truncatula序号No.种质名称Name of种质来源Origins序号No.种质名称Name of种质来源Originsgermplasmgermplasm1P219甘肃20WM5109甘肃Gansu,ChiGansu,Chnaina2WM5003甘肃21P5002甘肃Gansu,ChiGansu,Chnaina3P5001甘肃22WM
9、5510甘肃Gansu,ChiGansu,Chnaina4GN15甘肃23MP5002甘肃Gansu,ChiGansu,Chnaina5GN16甘肃24GN14甘肃Gansu,ChiGansu,Chnaina6WM5160甘肃25AFD甘肃Gansu,ChiGansu,Chnaina7Caliph甘肃26MP5008甘肃Gansu,ChiGansu,Chnaina8WM5511甘肃Gansu,Chi27WM5151甘肃Gansu,Chnaina9W5007甘肃28WM5086甘肃Gansu,ChiGansu,Chnaina10Pw14甘肃29WM5070甘肃Gansu,ChiGansu,Chn
10、aina11P5160甘肃30WT5005甘肃Gansu,ChiGansu,Chnaina12WM51甘肃31WM5501甘肃Gansu,ChiGansu,Chnaina13SA37澳大利亚32WM5007甘肃AustraliaGansu,China14SA36澳大利亚Australia33J008江苏Jiangsu,C15GC5160青海34TMhina江苏Qinghai,CJiangsu,Chinahina16FE62法国 French35FE61法国 French17P15法国 French36J1.11法国 French18J.51法国 French37A17法国 French19J1
11、.12法国 French38A20法国 French1.2 测定方法枝条伸展长度:出苗后60d,随机选取10个枝条,测定每个枝条从基部到伸长点的长度; 分枝数:出苗后60d,随机选取10株,测定分枝数;单株小花数:在开花期,每个材料随机 选5株,计数单株小花数;结荚数:在结荚期,每个材料随机选5株,计数结荚数;单株种子 产量:收获时统计株数,计算单株种子产量;每荚种子数:随机抽取10个荚果,统计每荚的 种子数;百荚重:随机抽取100个荚果称重;千粒重:随机抽取1000粒种子称重。1.3 PCR扩增反应体系SSR 和 SRAP 反应参照张丽芳和 Jennifer 的 PCR 扩增反应体系17,1
12、4。所用试剂来自上 海生工。表2 EST-SSR、SSR和SRAP引物名称和来源Table2 Name and origin of EST-SSR、SSR and SRAP primer名称Name来源Origin名称Name来源Origin名称Name来源OriginMt03蒺藜苜蓿(M.Mt52蒺藜苜蓿(M.Mt129蒺藜苜蓿(M.Mt15truncatula)蒺藜苜蓿(M.Mt53truncatula)蒺藜苜蓿(M.W6012truncatula)苜蓿 (M.sativa)Mt16truncatula)蒺藜苜蓿(M.Mt54truncatula)蒺藜苜蓿(M.Satt289大豆(G.ma
13、x)Mt19truncatula)蒺藜苜蓿(M.Mt55truncatula)蒺藜苜蓿(M.Satt297大豆(G.max)Mt36truncatula)蒺藜苜蓿(M.Mt56truncatula)蒺藜苜蓿(M.Satt311大豆(G.max)Mt46truncatula)蒺藜苜蓿(M.Mt59truncatula)蒺藜苜蓿(M.Satt346大豆(G.max)Mt48truncatula)蒺藜苜蓿(M.Mt61truncatula)蒺藜苜蓿(M.Me02大豆(G.max)Mt49truncatula)蒺藜苜蓿(M.Mt63truncatula)蒺藜苜蓿(M.Me03大豆(G.max)Mt50
14、truncatula)蒺藜苜蓿(M.Mt64truncatula)蒺藜苜蓿(M.Me04大豆(G.max)Mt51truncatula)蒺藜苜蓿(M.Mt110truncatula)蒺藜苜蓿(M.Me05大豆(G.max)truncatula)truncatula)注:Mt 和 W 开头的为 EST-SSR 引物;Satt 开头的为 SSR 引物;Me 开头的为 SRAP 引物。1.4 统计分析利用EXCEL和SAS9.0软件处理数据。采用类平均法(UPGMA)在NTSYS2.1版本上对分子 标记数据进行聚类。运用植物数量性状混合遗传模型主基因+多基因分离分析法对RILs群体 的种子产量进行分
15、析22。2. 结果分析2.1 蒺藜苜蓿种子产量相关性状的遗传变异及相关性分析参试蒺藜苜蓿种质种子产量及其构成因素间存在不同程度的遗传变异和相关性。单株种 子产量的变异较大,变幅为 1.023.4g(P0.05),J1.12 明显高于其他材料;枝条伸展长度的 变异较大,变幅为 1.222.1cm(P0.05);单株小花数的变异较大,变幅为 1.6147.1(P0.05);结荚数的变异 较大,变幅为 1.896.2(P0.05);百荚重变幅为 0.914.3g,A20 明显高于其他材料(P0.05) ;每荚种子数差异不显性(P0.05) ,变幅为4.012.0cm。枝条伸展长度与单株种子产量相关性
16、最大,相关系数物 0.719;单株小花数、 结荚数、分枝数,百荚重和千粒重与单株种子产量均呈正相关,相关程度基本相似,每荚种 子数与单株种子产量相关性最小。2.2 不同蒺藜苜蓿种质种子产量的聚类分析 根据各参试蒺藜苜蓿种质单株种子产量、百荚重和千粒重的观测结果进行标准化处理后,通 过系统聚类法,在平均类间距离为 10.0 处,参试蒺藜苜蓿种质可分为 3 个类群。各类型的划分和主要特征分别是:第类包括单株种子产量和千粒重均最大的 J1.12;第类包括 22份单株种子产量较小百荚重差异较大的材料;第类包括 14 份单株种子产量最大而千粒重 较小的材料。图 1 38 份蒺藜苜蓿种质聚类图Fig.1
17、Cluster dendrogram of 38 Medicago truncatula germplasm2.3 利用分子标记检测蒺藜苜蓿种质遗传多样性在蒺藜苜蓿种质单株种子产量、百荚重和千粒重聚类分析的基础上,从 3 个类群中筛选6 份来自不同类群,种子产量特性差异大的蒺藜苜蓿种质作为杂交亲本。利用 22 对 EST-SSR、4 对 SSR 和 4 对 SRAP 多态性较高的引物,检测这 6 份种质的多态性。采用 UPGMA 法进 行遗传相似性聚类,以 0.68 为阈值,将 6 份主要种质划分 4 种类型。A17、J1.12 和 WM51 的相似系数为 0.40,聚为一类,种子产量均相对较
18、大,亲缘关系较近。Caliph 单独成为一类, 其种子产量最小,与其它材料亲缘关系较远。图 2 基于 3 种标记的 6 份蒺藜苜蓿种质间聚类图Fig.2 Cluster dendrogram of 6 Medicago trucantula germplasm based on 3 markers2.4 蒺藜苜蓿 RILs 群体种子产量的分离分析2.4.1 A20A17 组合 RILs 群体种子产量最适遗传模型的筛选A20A17 组合 RILs 群体种子产量大部分集中于 29.536.5 之间,呈连续分布,有主峰 存在,提示有主基因存在。通过 IECM 算法获得 5 类 53 种模型的极大似然
19、函数值和 AIC 值, 根据 AIC 准则, B-1-1 模型和 E-1-1 模型的 AIC 值较小,可作为备选遗传模型。进一步对模型 分别进行适合性(U12、U22、U32、nW2 和 Dn)检验,选择统计量达到显著水平个数较少的模型 作为最优模型。结果表明,两个模型的 30 个检验统计量均没有达到显著性水平,但是 B-1-1 模型的 AIC 值比 E-1-1 模型的小。因此,该组合的种子产量的最适模型为 B-1-1 模型,即两 对加性-上位性主基因模型的遗传模式。根据 B-1-1 遗传模型中成分的分布和相应的均值, 计算模型的遗传参数。群体平均值为 30.08,主基因加性效应值为-0.89
20、 和 11.61,加性加性 效应为-7.37,表型方差为 93.38,环境方差为 41.21,主基因方差为 59.64,多基因方差为-7.47, 主基因遗传率为 63.9%,多基因遗传率为-0.08%。表 3 种子产量不同遗传模型的适合性检验Table3 Tests for goodness-of-fit of genetic model for seed yield模型Mod群体populatioU12适合性参数U22Parameter for goU32odness-of-fitnWDnelnB-1-P10.063(0.80170.009(0.92360.347(0.55590.034(P
21、0.00.184(P0.019)5)2)5)5)P22.379(0.12302.197(0.13820.002(0.96470.247(P0.00.389(P0.01)8)1)5)5)RILs0.040(0.84050.000(0.98300.482(0.48740.029(P0.00.043(P0.07)9)8)5)5)E-1-1P10.316(0.57420.590(0.44240.803(0.37010.069(P0.00.237(P0.06)8)3)5)5)F10.188(0.66420.113(0.73720.115(0.73480.041(P0.00.206(P0.07)0)0)5
22、)5)RILs0.073(0.78710.063(0.80200.002(0.96570.020(P0.00.030(P0.02)1)4)5)5)3. 讨论(1)本文通过研究发现蒺藜苜蓿种质种子产量及其构成因素间存在不同程度的遗传变异和相 关性。单株种子产量的变异较大,J1.12 明显高于其他材料。不同种质的枝条伸展长度、分 枝数、单株小花数、结荚数和百荚重间均存在显著差异。枝条伸展长度与单株种子产量相关 性最大,本研究认为可以通过增大枝条伸展长度来提高种子产量,但是它的稳定性和受环境 影响程度还的进一步研究。单株小花数、分枝数、结荚数、百荚重和千粒重与种子产量呈正 相关,小花数很少受环境因素
23、的影响,可作为选育高种子产量品种的一个性状,千粒重在一 定的环境下对于一个品种来说是一个比较稳定的性状,但靠增加千粒重来提高种子产量是有 限的。本研究中每荚种子数与种子产量相关性最小。 (2)根据蒺藜苜蓿的表型性状确定标记与表型的一致性,进而找出控制特定性状的基因。通 过系统聚类法分析参试蒺藜苜蓿种质单株种子产量、百荚重和千粒重,结果显示,参试蒺藜 苜蓿种质可分为 3 个类群。通过对 30 对多态性较高的引物扩增结果的聚类分析显示,A17、 J1.12 和 WM51 亲缘关系较近,它们的单株种子产量均较高,每荚种子数基本一致。Caliph 属于蒺藜苜蓿内的另一个品种,与其它 5 份种质亲缘关系
24、较远,这与种子产量聚类结果基本 相似。分子标记能够更加准确的揭示材料间的遗传差异,为种质资源的鉴定提供了保障。三 种标记在蒺藜苜蓿种质的扩增上多态率差异较小,来自大豆的 SSR 标记扩增的多态率相对 较低,EST-SSR 和 SRAP 标记扩增的多态率相对较高。SRAP 作为一种新型分子标记,在植 物群体遗传结构分析和系统演化分析中潜能较大。(3) RILs 群体是杂种后代经过多代自交而产生的一种永久性分离群体。本文利用主基因+多 基因混合模型对蒺藜苜蓿 A20A17 组合 RILs 群体种子产量性状进行遗传分析,发现该组合 的 RILs 群体种子产量性状的最佳遗传模型为两对加性-上位性主基因
25、遗传模型,以主基因为 主,多基因遗传率较低。该研究方法是快速鉴定与目标基因连锁的分子标记的有效方法,不 仅可以筛选最佳遗传模型,而且能估计主基因的遗传率,对遗传育种工作有一定的指导作用。4. 结论(1)参试蒺藜苜蓿种质种子产量及其构成因素间存在不同程度的遗传变异和相关性。单株种 子产量、枝条伸展长度、分枝数、单株小花数、结荚数和百荚重的变异较大(P0.05);枝条伸展长度与单株种子产量相关性最大,相关系数物0.719;每荚种子数与单株种子产量相关性最小;其它性状与单株种子产量均呈正相关。 (2)通过系统聚类法,将参试蒺藜苜蓿种质单株种子产量、百荚重和千粒重进行聚类分析, 在平均类间距离为 10
26、.0 处,参试蒺藜苜蓿种质可分为 3 个类群。筛选 6 份来自不同类群, 种子产量特性差异大的蒺藜苜蓿种质作为杂交亲本。(3) 利用22对EST-SSR、4对SSR和4对SRAP多态性较高的引物,检测6份亲本种质的多态性, 采用UPGMA法进行遗传相似性聚类,6份亲本多态性差异明显。(4)蒺藜苜蓿 A20A17 组合的 RILs 群体种子产量性状的最佳遗传模型是两对加性-上位性主 基因模型。该组合群体种子产量遗传以主基因为主,多基因遗传率较低,第二对主基因的加 性效应值高于第一对主基因的加性效应值。5. 致谢上海植物生理研究所罗达先生和上海交通大学马伟先生提供部分蒺藜苜蓿种质和 RILs群体,
27、谨此致谢。参考文献1 韩建国,李敏,季枫.牧草种子生产中的潜在种子产量与实际种子产量J.草原与牧草,1996,(1):7112 吴素琴 , 张自和 . 紫花苜 蓿植株群体花 序花朵数及 荚内种子数的 数量特征分 析 J. 草业学 报,2003,12(5):77803 李世雄,王彦荣,孙建华.中国苜蓿品种种子产量性状的遗传多样性J.草业学报,2003, 12(1):23294 王显国,韩建国,刘富渊,等.刈割对紫花苜蓿生殖生育期的调控及对种子产量和质量性状的影响J.草地学 报,2005,23(4):2742775 姜 华,毕玉芬.紫花苜蓿生殖生物学特性研究J.草地学报,2008,16(2):11
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33、003:12012620 徐辰武,胡治球,王学枫,王伟.胚乳性状主基因的分离分析方法J.中国农业科学,2005,38(7):13171323Genetic Analysis of Seed Yield in Medicago truncatulaLEI Yan-fang1, WEI Zhen-wu2, YANG Zhan-hua1, GAI Jun-yi3, WANG Yi-ming11.College of Grassland Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou, Gansu Province(730070)2. College o
34、f Animal Science & Technique, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu Province(225009)3. National Center for Soybean Improvement, Nanjing Agricultural University, Nanjing, JiangsuProvince (210095)AbstractBased on the characteristic of seed yield of Medicago truncatula, analyzing its seed yield compon
35、ents. The result shows that there is large variation in seed yield per plant and other components (P0.05),except for the weight of thousand seeds and seed number per pod. The branch length and seed yield per plant is highly correlated and lower with the seed number per pod and seed yield per plant.
36、Other components and seed yield per plant are positively correlated. Medicago truncatula germplasm can be divided into 3 groups by cluster analysis. 6 parents germplasm large variation from different groups are selected as hybrid parents. Detecting with 22 pairs of EST-SSR, 4 pairs of SSR and 4 pair
37、s of SRAPpolymorphism higher primer, significant difference is showed among their polymorphism. The heredityof seed yield of RILs population from cross A20A17 is under the control of two additive-epistatic-major genes. The major gene heritability play a major role and the genetic variance of poly gene is lower, additive effect of the second major gene is larger than the first major gene. Keywords :Medicago truncatula Gaertn.; Seed yield; Cluster analysis; Major gene plus poly geneinheritance analysis; EST-SSR maker; SRAP maker作者简介:雷艳芳(1981-),女,甘肃景泰,硕士研究生,研究方向为牧草遗传育种。
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