酿酒葡萄中与原花色素生物合成相关的【推荐论文】 .doc
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1、精品论文酿酒葡萄中与原花色素生物合成相关的MYB 家族转录因子启动子的克隆与功能 研究5何非1,李强1,朱保庆1,2,潘秋红1,段长青1(1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;2. 北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083)摘要:原花色素是葡萄果实中的一类重要的多酚代谢产物,对葡萄和葡萄酒的口味有着重要 的影响。近年来,一些涉及葡萄果实原花色素生物合成的调节基因得以被发现,其生理功能10也得到了阐明。特别是对葡萄 MYB 家族一系列转录因子的发掘,极大的推动了本领域相关 研究的发展。而到目前为止对这些调节基因启动子结构和功能的研究还非常有限。本研究旨 在克隆与
2、酿酒葡萄原花色素生物合相关的转录因子 VvMYBPA1、VvMYBPA2 和 VvMYB5a 的启动子序列,通过生物信息学对其潜在功能进行预测,通过启动子重组载体侵染烟草叶片 来检验其基本功能。研究发现,与原花色素生物合成有关的这些关键结构基因的启动子相比,15这些调节基因的启动子序列在潜在功能上有着极大的不同,特别是光响应元件在种类和数量 上的差别较大,且多含有其它转录因子和不同激素信号的响应位点。而启动子活性检验则表明,这些目标序列具有启动子的基本活性,且 UV-B 照射可以导致报告基因表达量的略微增 加,表明它们具备一定的响应紫外诱导的功能。 关键词:酿酒葡萄;原花色素;调节基因;启动子
3、;克隆;功能20中图分类号: S663.1Cloning and Functional Study for Promoters of MYB Family Transcription Factor Related to Proanthocyanidin Biosynthesis in Wine Grapes25HE Fei1, LI Qiang1, ZHU Baoqing1,2, PAN Qiuhong1, Duan Changqing1(1. China Agricultural University, College of Food Science and Nutritional Engi
4、neering,Beijing 100083;2. Beijing Forestry University, College of Biological Sciences and Technology, Beijing 100083)Abstract: Proanthocyanidins are an important group of polyphenolic metabolites in grape berries,30which have great influences on the taste of grape and wine. In recent years, some reg
5、ulatory genesrelated to proanthocyanidin biosynthesis in grape berries were found, and their physical functions were also clarified. Especially the studies of a series of regulator of MYB family in grapes have greatly developed the researches in this area. However, until now the researches for the s
6、tructures and functions of the promoters of these regulatory genes are still quite limited. In the present study,35the promoter sequences of the regulatory genes VvMYBPA1、VvMYBPA2 and VvMYB5a whichare related to proanthocyanidin biosynthesis were cloned, their potential functions were predicted with
7、 the help of bioinformatics, and their basic functions were tested by using infecting of promoter combinant vector on tobacco leaves. This research revealed that compared to the structure genes related to proanthocyanidin biosynthesis, the promoters of these regulatory genes40were quite different in
8、 the structure and the protentional functions, especially in the kinds and numbers of the photoresponse elements, and they often contain the response sites to other different regulators or phytohormone signals. Besides, the function test revealed that all these aimed sequences had the basic function
9、s of promoters, and after the irraidation of UV-B the expression of the report genes increased slightly, showing their function in responding the induction of UV.基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金资助(90008110018)作者简介:何非,(1983-),男,讲师,主要研究方向:酿酒葡萄分子生物学与葡萄酒化学。通信联系人:段长青,(1964-),男,教授,主要研究方向:酿酒葡萄风味代谢与调控、葡萄酿酒品质评 价、葡萄酒酿造与葡
10、萄酒化学。 E-mail: - 10 -45Keywords: Wine Grapes; Proanthocyanidin; Regutory Genes; Promoters; Cloning; Function0引言原花色素是葡萄果实中重要的多酚类次生代谢产物,不仅可以为葡萄和葡萄酒贡献一定 的苦和涩的味道1-2,通过辅色效应影响葡萄酒的颜色3-4,还会影响葡萄酒香气物质的表现505,因而对葡萄酒、特别是红葡萄酒的感官品质有着重要的影响。 随着对植物原花色素生物合成研究的不断深入,人们发现了该路径一系列重要的结构基因及其蛋白的生理功能,特别是无色花色素还原酶(Leucoanthocyani
11、din reductase; LAR)和 花色素还原酶(Anthocyandin reductase, ANR)。前者可以催化一系列二氢黄烷酮生成 2R, 3S- 黄烷-3-醇类物质,如(+)-儿茶素、(+)-棓儿茶素、(+)-阿福儿茶精,后者则可以催化55一系列花色素生成 2R, 3R-黄烷-3-醇类物质,如(-)-表儿茶素、(-)-表棓儿茶素、(-)- 表棓儿茶素-3-O-没食子酸酯和(-)-表阿福儿茶精等,这两类黄烷-3-醇物质都是原花色素生 物合成的重要组成单元,对于酿酒葡萄果实的研究也进一步证明了这一点6-8。近年来,葡萄果实中调控苯丙烷代谢和类黄酮代谢的转录因子被陆续鉴定。迄今认为
12、至 少有六个家族的转录因子(MYB、bHLH、WD40、WRKY、锌指及 MADS box 蛋白)参与60了植物原花色素生物合成的调节,其中针对 MYB 家族转录因子的研究最为广泛。到目前为止,已发现了三个能够调控葡萄果实原花色素生物合成关键基因表达的 R2R3-MYB 类转录 因子,即 VvMYB5a9、VvMYBPA110和 VvMybPA2 11,在葡萄中,这些转录因子的基因表 达与原花色素的积累是同步的,即这些转录因子可以调节葡萄无色花色素还原酶和花色素还 原酶基因在转录水平的表达。65然而,尽管人们对葡萄及其它作物原花色素生物合成关键结构基因和调节基因的研究不 断深入,但到目前为止,
13、对这些基因启动子序列、结构和潜在功能的研究还较为有限。本研 究旨在结合分子生物学和生物信息学的相关技术,对酿酒葡萄赤霞珠原花色素生物合成关键 调节基因 VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 的启动子进行克隆,并对其潜在功能进行预 测,并对其基本生理功能进行验证,以期对本领域的进一步深入研究奠定一定的理论基础。701材料方法1.1 材料植物材料:2010 年 8 月采自河北省怀来县中法葡萄酒庄园的赤霞珠葡萄(Vitis viniferarL. cv. Cabernet Sauvignon)嫩叶,嫩叶经去离子水清洗晾干后,迅速用液氮速冻并储存于-80待用。75药品试剂:植物基因组
14、 DNA 提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司;Taq plus 聚 合酶和 DNA marker DL 2000,大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 感受态细胞,DNA 凝胶回 收试剂盒购自天根生化公司;表达载体 pMD19-T 质粒,T4 连接酶,Oligo (dT)18,DNase I 限制性内切酶购自于日本 Takara 公司;反转录酶购自 Promega 公司;MS 培养基、乙酰丁香 酮均购自 Sigma 公司;D-荧光素(D-Luciferin K salt)购自海德生物有限公司。所有寡聚糖80核苷酸引物的制备由上海生工承担。1.2 方法1.2.1葡萄果实基因组
15、DNA 的提取采用上海生工生物工程有限公司植物基因组 DNA 提取试剂盒,并有所改动。1.2.2VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 启动子的克隆85根据 NCBI 数据库中已知 VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 的 cDNA 序列,于 NCBI 葡萄基因组数据库(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch& PROG_DEF=blastn&BLAST_PROG_DEF=megaBlast&BLAST_SPEC=OGP 29760 12992) 和 Grape Geno
16、me 葡萄基因组数据库(http:/s.fr/blat-server/cgi-bin/vitis/ webBlat)中进行铆钉比对,查询起始密码子上游 1000 bp 范围内的序列信息,设计引物如90表 1 所示,采用设计的特异引物对目标基因启动子进行扩增。表 1 VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 启动子特异引物的设计Table 1 Design of the specific primers for VvMYB5a、VvMYBPA1 and VvMybPA2基因名称退火温度()预测扩增片段长度(bp)含有启动子片段长度(bp)引物序列VvMYBPA146.9997940
17、S: TTTCGTATTTGTTCTCAAAAA: GGCAGTCCATGAACCTCTATVvMYBPA254.010491019S: GTGTTTGGCTGCTGGGAAATA: CTCTTTGGCACAGCAAGGTCVvMYB5a52.11047994S: TGGGAAGAGGAAGTCTCACGA: ACCTTGGTACAGCACGGAGT95100105110以赤霞珠葡萄总 DNA 为模板,采用梯度 PCR 法对 VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2的启动子进行扩增,并对扩增片段进行测序和拼接比对。1.2.3启动子功能预测利 用已经 得到的目 标基因 的启动 子序
18、列 ,在 PlantCARE 在线软 件( http:/ bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中进行比对分析,分析目标基因启动子 序列中的顺式作用原件,特别是潜在的光响应元件及其配件,以及与转录因子有关的顺式作 用元件12。1.2.4目标启动子 LUC 荧光表达载体的构建将克隆得到的 VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 的启动子片段进行双酶切后,重组 到改造的 pCAMBIA 1300-LUC 载体(改造后使其含有 LUC 全长片段)上,并转化 E.coli DH5 筛选阳性克隆,经过菌落 PCR 和酶切
19、鉴定正确后,送测序公司测序。提取测序正确的质粒 DNA 待转入农杆菌,用于后续实验。1.2.5烟草叶片的侵染将测序正确的农杆菌转接至含有 50 g/mL 的硫酸卡那霉素的 LB 液体培养基中,28,240 rpm 振荡培养过夜,至菌液浓度为 OD600=1.0 时,吸取 1mL 菌液至 1.5 mL 离心管中,4000 rpm 离心 5 min 集菌。用 1 mL 烟草注射缓冲液将菌重新悬起,4000 rpm 离心 5min,弃 上清,重复三次。用适量的烟草注射缓冲液将细胞悬起使其 OD600=0.6,静置 4 h。将菌液 注射至生长 6 周左右的烟草叶片中,正常光照培养 48-60 h。精品
20、论文1.2.6启动子活性检测叶片用 1D-荧光素工作液处理后,使用荧光成像系统(Andor iXon)拍照观察。1151201251301351.2.7紫外光诱导处理将构建好的目标基因启动子瞬时荧光表达载体转化根癌农杆菌,用农杆菌侵染烟草叶 片,暗培养 48 小时后,将烟草叶片沿中间叶脉分为两部分,其中 1 份不经紫外处理,用标 签纸包裹做黑暗对照,另一份在室温为 25的暗处分别用 UV-B(305 nm)照射,紫外灯管 距烟草叶片表面约为 50 cm,达到 1.8 kJ/m2 的照射剂量,照射达到相应剂量后立即将烟草叶 片取出,以待后续检测启动子活性,重复三次。2结果讨论2.1葡萄基因组 D
21、NA 的提取以赤霞珠葡萄嫩叶为材料,采用改进的上海生工生物工程有限公司植物基因组 DNA 提 取试剂盒提取葡萄基因组 DNA。最终得到的葡萄基因组 DNA 质量高,并且无杂带污染, 可用于目标关键基因启动子的克隆。葡萄基因组 DNA 的电泳结果如图 1 所示。图 1,葡萄基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 1 Agarose gel electrophoretic analysis of genomic DNA isolated from Cabernet Sauvignon grapes2.2关键基因启动子的预测与克隆采用生物信息学方法,利用已有文献报道的或葡萄基因组信息预测的结构基
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