5杂氮2脱氧胞苷对鼻咽癌细胞株细胞周期及1433σ基因甲基化的影响.pdf
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1、5 3 6 文章编号:1 0 0 7 6 6 1 1 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 5 3 6 0 5 些亘匡型太堂堂塑( 迦丛鱼业1 2 至鲤曼生鱼旦:垫( 鱼2 5 一杂氮一2 7 一脱氧胞苷对鼻咽癌细胞株细胞周期及1 4 3 3 仃基因甲基化的影响 谭双香,易红。汤参娥,陈主初, 肖志强 ( 中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长 沙4 1 0 0 0 8 ;。通讯作者,E - m a i l :z q x i a 0 2 0 0 1 幽0 0 n 1 c r I ) 摘要:目的探讨5 一杂氮一2 L 脱氧胞苷( 5 一a z a - 2 d C ) 对鼻咽癌细胞株C
2、N E l 、C N E 2 、5 8 F 、6 1 0 B 增殖、凋亡和细胞周期分 布的影响,并进一步分析5 一a 功一2 d C 处理对1 4 3 3 a 基因甲基化状态的影响。方法用不同浓度5 a z a - 2 d C 处理鼻咽癌细 胞,M T T 实验观察细胞生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡比例,用甲基化特异性P C R ( M S P ) 分析1 4 3 3 a 基 因甲基化状态。结果5 一a z a 一2 d C 对4 株细胞均有生长抑制作用,C N E l 和6 - 1 0 B 细胞对药物敏感性高于C N E 2 和5 8 F 。5 a z a - 2 d C 处理
3、使4 株细胞凋亡率出现剂量依赖性的增加,C N E l 和6 1 0 B 细胞对药物敏感性高于C N E 2 和5 - 8 F 。经5 a z a - 2 d C 处理后,C N E l 、C N E 2 、6 1 0 B 细胞出现不同程度的G D 偈期阻滞,而5 8 F 表现为G o 偈期和G 2 M 期双期阻滞。不经5 a z a - 2 d C 处理情况下4 株细胞1 4 3 3 0 基因均存在不同程度的甲基化,5 a z a - 2 d C 处理能够使1 4 3 3 0 基因去甲基化。 结论5 a z a - 2 d C 具有抗鼻咽癌作用,抑制作用强弱可能与鼻咽癌分化程度和转移潜能有一
4、定关系,其机制可能与使1 4 3 3 d 等抑瘤基 因去甲基化有关。 关键词:5 一杂氮一2 一脱氧胞苷;鼻咽肿瘤;细胞周期;凋亡;甲基化 中图分类号:R 7 3 9 6文献标识码:A I n n l l 哪l C eo f $ - a z a - 2 “ - d e o x y c y t i d i n eO i lc e l lc y c l eo fn a s o p 唰c 脚他i n 吣c e l ll i n e sa n dm e t h y l a t i o no f1 4 - 3 - 3 0 “ g e n e T A NS h u a n g - x i a n g ,Y
5、 IH o n g ,T A N GS h e n - e ,C H E NZ h u - c h u ,X I A OZ h i q 妇1 9 。( K e yL a b o r a t o r yo f C a n c e rP r o t e o m i c so f C h i 一 僦M i n i s t r yo fH 缸Z 确,X i a n g y aH o s p i t a l ,C e n t r a lS o u t hU n i v e r s i t y ,O m n g s h a4 1 0 0 0 8 ,C h i n a ;* C o r r e s p o
6、n d i n ga u t h o r ,E - m a i l : z q z a 0 2 0 0 1 蜘c o m 仰) A b s t r a c t : O b j e c t i v e T oe x p l o r et h ei n f l H e n c eo f5 a z a - 2 - d e o x y c y t i d i n e ( 5 一a z a - 2 d C ) o nt h ep r o l i f e r a t i o n ,a p o p t o s i sa n dc e l lc y c l eo f f o u rn a s o p h m
7、懈ae s r c i n o l T l ae e l ll i n e sC N E l ,C N E 2 ,5 8 Fa n d6 - 1 0 B ,a n dt oi n v e s t i g a t et h ei n f l u e n c eo f5 a z a - 2 d Co nm e t h y l a t i o n 0 f1 4 3 3 ag e n e M e t h o d sN a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m ao e ul i n e sw e r e 仃e a t e dw i t hd i f f e r
8、e n tc o n c e n t r a t i o n so f5 一a z a - 2 d C M 兀、8 5 一 s a yw a su s e dt od e t e c tt h ec e l lg r o w t h F l o wc y t o m e t r yw a su s e dt Od e t e r m i n ec e l lc y c l ea n da p o p t o s i s M e t h y l a t i o ns p e c i f i cP C Rw a s u s e dt Oe v a l u a t eh y p e r m e t
9、h y l a t i o ns m t u so f1 4 3 3 ag e n e R e s u l t sP r o l i f e r a t i o no fC N E l 。( :3 啦,5 - 8 F ,6 1 0 Bw e r ea l li n h i b i t e d b y5 一a z a - 2 d C ,a n dC N E la n d6 - 1 0 Bw e r er l l o r es e n s i t i v et h a nC N E 2a n d5 8 F T h ea p o p t o s i ai n c r e a s e dd o s e
10、 - d e p e n d e n t l ya f t e r5 a 趾 2 d Ct r e a t m e l a ti na l lf o u rc e Hl i n e s m a dC N E la n d6 1 0 Bw e r eI T l O l es e n s i t i v et h a nC = N E 2a n d5 8 F a 咂1 ,( = N E 2a n d6 1 0 Bw e r e b l o c k e di nG 0 qp h a s e ,w h i l e5 8 Fw a sb l o c k e di nG o G lp h a s ea n
11、 dG 2 Mp h a s ea f t e r5 一a z a - 2 d Ct r e 删M e t h y l a t i o no f1 4 3 3 0 g e n ew a sf o u n di nd i f f e r e n td e g r e ei nf o u rn a s o p h a r y n g lc L r c i r l o l l l ac e l ll i n e sb e f o r e5 一a z a - 2 d Ct r e a t m e l l t A f t e r5 a z a - 2 d Ct r e a t m e n t , d e
12、 - m e t h y l a t i o no f1 4 3 3 0g e n ei n c r e a s e di nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r C o n c l u s o n5 一a z a - 2 d Ch a st h ee f f e c to fa n t i n a s o p l a J j ,n g e a l c s c i n o n m ,a n di t se f f e c tm a yb er e l a t e dw i t ht u m o rd i f f e r e n t i a t i o
13、na n dm e t a s t a s i sp o t e n c y ,w h i c h u l db er e l a t e dt Od e - m e t h y l a t i o no f t u m o r - s u p p r e s sg e n es u c ha s1 4 3 3 a K e yw o r d s : 5 一a z a - 2 - d e o x y c y t i d i n e ; n a s o p h a r y n g 豳ln e o p l a s m ; c e l lc y c l e ; a p o p t c 8 i s ;m
14、 e t h y l a t i o n 人类基因组中约一半基因具有C p G 岛,正常细 胞基因的C p G 岛处于非甲基化或低甲基化状态,基 因C p G 岛出现甲基化程度增高简称基因甲基化或 D N A 甲基化。细胞周期调控基因甲基化导致细 胞周期失控在肿瘤研究中越来越受到重视。5 一杂 氮一27 一脱氧胞苷( 5 一a z a 一2 - d e o x y c y t i d i n e ,5 一a t e - 2 d C ) 是目前研究最多的去甲基化药物,能够逆转基 因的甲基化状态,从而恢复基因的表达水平,纠正 肿瘤细胞的异常生物学特征 2 ,3 J 。5 a z a 2 d C 目
15、前 已经用于白血病和多发性骨髓瘤的临床治疗,但尚 未用于临床治疗实体瘤。研究发现鼻咽癌发病与 多种细胞周期调控基因的甲基化有关 4 t5 | ,5 a z a 2 d C 对鼻咽癌是否具有治疗作用尚少见报道。1 4 3 3 d 基因是一个重要的细胞周期调控基因,其甲基 基金项目:教育部跨世纪优秀人才培养计划基金资助项目( 教育部科技函 2 0 0 2 4 8 ) ;芙蓉学者特聘教授科学研究基金资助项目( 湘 教通 2 0 0 7 1 3 6 2 号) ;湖南省科技重点科研基金资助项目( 0 6 & ( 2 0 0 4 ) 万方数据 些亘匿型盍堂堂塑( 壁里墨堑丛鱼型匦立呈Q Q 墨生鱼旦:垫f
16、 鱼2 化参与多种肿瘤的发病机制 6 | ,5 - a z a 2 d C 是否影响 鼻咽癌中1 4 3 3 d 基因的甲基化状态尚未见报道。 本研究观察了不同浓度5 一a z a - 2 d C 处理对C N E l 、 C N E 2 、5 8 F 、6 1 0 B4 株鼻咽癌细胞的增殖、凋亡和 细胞周期分布的影响,并进一步分析5 - a z a 一2 d C 对 鼻咽癌细胞株1 4 3 3 d 基因甲基化状态的影响。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 细胞株鼻咽癌细胞株5 8 F ( 高成瘤,高转 移) 和6 1 0 B ( 成瘤,不转移) 由中山大学建立,是 N P C 细胞株
17、S U N E I 的两个亚株,具有相同的遗传 背景 7 - 9 。鼻咽癌细胞株C N E l ( 高分化) 和C N E 2 ( 低分化) 由本室保存。 1 1 2 试剂1 0 小牛血清和R P M l l 6 4 0 培养基 购自H y c l o n e 公司,5 - a z a 一2 d C 、重亚硫酸钠和氢醌购 自S i g m a 公司,碘化丙啶购自北京中山公司,W i z a r d G e n o r r d eD N AP u r i f i c a t i o nK i tD N A 提取试剂盒和 W i z a r dD N AC l e a n - u pS y s t
18、 e mD N A 纯化试剂盒购 自P r o m e g a 公司,P C R 所用B u f f e r 、d N T P 、M g C l 2 和 T a q 酶均购自T a k a r a 公司。 1 1 3P C R 引物1 4 3 3 a 基因P C R 扩增引物序 列参照文献 1 0 。引物由T a l c a r a 公司合成。扩增 甲基化D N A 片段的正向和反向引物序列分别为 57 1 、C ;( 了r A G l _ r I T A T G A A A G G C G T C 一37 和 5 一C C r ( 汀A A C C a 0 C C A C C A C G 一
19、3 ;扩增片段长 度为1 0 4b p ( 对应基因库中g i :2 7 0 2 3 5 2 D N A 序列之 8 7 0 2 至8 8 0 5 位核苷酸) ;扩增非甲基化D N A 片段 的正向和反向引物序列分别为5 一AT I X 汀A G 1 v 】r r T A T G A A A G G 丑、( ;T T 一3 和57 一C C C T C T A A C C A C C C A C C A C A 一37 ,扩增片段长度为1 0 6 b p ( 对应基因库中g i :2 7 0 2 3 5 2 D N A 序列之8 7 0 1 至 8 8 0 6 位核苷酸) 。 1 2 方法 1
20、 2 1 细胞培养C N E l 、C N E 2 、5 8 F 和6 1 0 B 用 含1 0 小牛血清的R P M l l 6 4 0 培养基、在3 7 、 5 C 0 2 培养箱中培养。 1 2 2四唑盐( M T T ) 比色检测细胞生长将对数 生长期的4 株鼻咽癌细胞以1X1 0 4 细胞1 0 0 肚l 密 度接种于9 6 孔培养板中,每孔2 0 0t t l ,每组5 孔,培 养细胞6h 后,加入不同浓度的5 - a z a 一2 d C ( 0 ,0 1 , 1 ,5 ,1 0t u m o l L ) ,每2 4h 更换含5 a z a 一2 d C 的新鲜 培养基,共培养6
21、d 。分别在5 一a z a 2 d C 作用1 6d 后采用,每孔加入5m g m l 肼溶液2 0p l ( 以P B S 5 3 7 代替M T T 溶液作为阴性对照) ,继续培养4h ,终止 培养,去除孔内上清液,每孔加入1 5 0t t l 二甲基亚 砜( D M S O ) ,震荡1 0m i n ,在4 9 0n l “ n 波长下,以空白 孔调零,在酶标仪上测定各孔吸光度值( A ) ,绘制细 胞生长曲线。实验重复3 次。 1 2 3 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡6 1 0 4 m l 细胞接种于2 5m l 培养瓶,培养6h 后加不 同浓度( 0 ,0 1 ,1 ,5 ,
22、1 0t l m o l L ) 的5 - a z a 一2 d C ,每2 4 h 更换含5 8 z a 一2 d C 的新鲜培养基,7 2h 后更换为不 含5 一a z a 2 d C 的培养基再培养2 4h 。收集实验组和 对照组细胞,冷P B S 洗涤2 次,4 7 0 乙醇固定2 h 。调整细胞浓度为1 0 6 个细胞m l ,取1m l 细胞悬 液,P B S 洗3 次,与含2 0p g m lR N A 酶的“S H C l 缓冲液3 7 孵育3 0m i n ,用5 0 肛g m l 的碘化丙锭 ( P I ) 进行细胞D N A 染色。样品用B e c k m a nC o
23、u l t e r 公司F C5 0 0M C L M P L 流式细胞仪检测细胞周期 和细胞凋亡情况,采用M u l t i e y e l ef o rW i n d o w s 数据 分析系统进行数据分析。 1 2 4 甲基化特异性P C R ( m e t h y l a t i o ns p e c i f i c P C R ,M S P ) 检测1 4 3 3 d 基因的甲基化水平药物 处理细胞方法同1 2 3 。收集实验组和对照组细 胞,进行M S P 分析。M S P 的简要步骤如下:抽提基 因组D N A ,用P r o m e g a 公司的G e n o m i cD
24、N AP u r i f i c a t i o nK i t 试剂盒按说明书步骤提取细胞基因组 D N A ,1 4 琼脂糖凝胶电泳检测D N A 完整性后 一8 0 保存备用;重亚硫酸钠修饰D N A ,2 弘gD N A 稀释于5 0 肛I 水中,加入5 5 “I 新鲜配制的3t o o l L 氢氧化钠,4 2 变性3 0m i n ,再加入5 2 0 肚l 新鲜配 置的3 6t o o l L 、p H 5 0 的重亚硫酸钠和1 0m o l L 的氢醌3 0 肛l ,石蜡油覆盖避光,5 5 水浴1 6h ;纯 化回收D N A ,用P r o m e g a 公司的D N AC l
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- 杂氮 脱氧 鼻咽癌 细胞株 细胞周期 1433 基因 甲基化 影响
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