BCL2 SIRNA抑制HL60细胞BCL2基因表达.pdf
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1、mgkg -1, ip)to observe the effect of l-THP on mor- phine-induced CPP; With daily injection of l-THP (ip)at different doses, effect on the extinguishment of morphine-induced CPP was tested weekly; Normal saline(NS)or l-THP(1. 25 5. 00 mgkg -1,ip) was used as a training drug to test whether l-THP coul
2、d induce CPP in the rats. Results 5. 00 mg kg -1 morphine(sc)induced CPP;l-THP of 2. 50 mg kg -1 and 5. 00 mgkg -1 administered prior to the tes- ting reduced the expression of morphine-induced CPP significantly(P 0. 05)and chronic administration of these agents both accelerated the extinguishment o
3、f morphine-induced CPP obviously. None of the three doses of l-THP induced CPP. Conclusion l-THP can inhibit the rewarding effect induced by morphine and may play a role in the treatment of morphine addiction. Key words: l-THP;morphine;conditioned place pref- erence Bcl-2 siRNA 抑制 HL-60 细胞 bcl-2 基因表
4、达 雷小勇1, 燕春艳2, 涂玉林2, 钟 苗1, 冯兰芳1, 廖端芳1 (南华大学 1. 药物药理研究所; 2. 心血管疾病研究所, 湖南 衡阳 421001) 中国 图 书 分 类 号: R 329. 25; R 341; R 342. 2; R 394-3; R 394. 2; R 733. 705. 3; R 977. 6 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 12 -1445 -06 摘要: 目的 应用 RNA 干扰技术观察 Bcl-2 siRNA 对白血病 细胞 HL-60 中 bcl-2 基因表达的影响, 探讨 siRNA 技术在白 血病治疗中的作用。
5、方法 利用化学合成法体外化学合成 Bcl-2 siRNA, 将 Bcl-2 siRNA 与 HL-60 细胞共孵育, 用 MTT 法、 荧光染色观察细胞增殖及凋亡情况, 用 RT-PCR 检测 Bcl-2mRNA 水平, 用荧光染色测 Bcl-2 蛋白水平。结果 Bcl- 2 siRNA 与 HL-60 细胞共孵育 48 h 后, HL-60 细胞凋亡率增 加, Bcl-2mRNA 水平下调, Bcl-2 蛋白表达水平降低。转染 GAPDH siRNA 组的细胞对 Bcl-2 表达无影响。结论 Bcl-2 siRNA 能够特异性降低 Bcl-2 mRNA 水平及蛋白质的表达, 促进 HL-60
6、 细胞凋亡。 关键词: RNA 干扰; bcl-2; siRNA;HL-60 研究表明: 近 50% 的肿瘤细胞中都有 bcl-2 基 因的高表达 1, 2, bcl-2 基因几乎表达于除红细胞系 外所有的造血细胞系。Bcl-2 蛋白表达的高低与肿 瘤细胞对多种化疗药物敏感性密切相关 3, bcl-2 基 因的过度表达可明显降低化疗药物引起的细胞凋 亡。近些年来利用反义寡核苷酸技术阻断 bcl-2 基 因表达的研究已取得了很大进展 4 7。但是由于反 收稿日期: 2005 -08 -08, 修回日期: 2005 -09 -26 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (No 30300426)
7、、 湖南省教育 厅青年基金资助项目 (No 200416) 作者简介: 雷小勇 (1970 - ) , 男, 博士, 副教授, 研究生导师, 研究方 向, 肿瘤药理学, E-mail: lei-xiaoyong hotmail. com, Tel: 0734-8281408 义物质的稳定性不高、 摄入率低、 毒性较大和对 mR- NA 的非特异性阻断等问题阻碍了反义技术在疾病 治疗上的进一步应用 8, 9。RNA 干扰 (RNA interfer- ence, RNAi) 是最近几年发展起来的新兴的基因阻 断技术。它通过内源性或外源性双链 RNA (double- stranded RNA,
8、dsRNA) 触发同源性 mRNA 的降解, 从而使该基因表达沉寂 10, 11。RNAi 具有高度的序 列专一性, 可以特异地使基因沉默, 而且少量的 dsRNA 可促进大量同源 mRNA 的降解 5, 6, 12。本实 验以 HL-60 细胞为研究对象, 观察 Bcl-2 siRNA 对 细胞的 bcl-2 基因表达的影响, 为白血病的基因治疗 奠定了一定的基础。 1 材料和方法 1. 1 材料与试剂 siRNA 构建试剂盒, Cy3 荧光标 记试剂盒及 siPORT Lipid 转染试剂盒均为 Ambion 公司产品。FITC 标记 Bcl-2 一抗购自 BD PharMin- gen
9、公司。GAPDH 一抗购自美国 Ambion 公司。 PRE 标记 GAPDH 二抗 为 DAKO 公司产品。RT 试 剂盒为 Promega 公司生产。Trizol 试剂盒为美国 GIBCO 公司产品。Taq 酶和 dNTP 是中国上海生工 公司产品, 其它试剂为进口或国产分析纯。 1. 2 siRNA 合成 扫描 Bcl-2 mRNA 的全序列记录 AA 及下游 19 个核苷酸, 选取距离 AUG 启动子约 30 个核苷酸以后的靶序列作为 Bcl-2 siRNA 的模 板, 且 GC 含量控制在 30% 65% 之间, 使用程序 Blast(http: / / www. ncbi. nlm
10、. nih. gov/ blast)对上述 序列进行人类基因组相似性评估证实序列在人类基 因组中具有唯一性, 然后在各正反义模板靠近 3端 5441中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec; 21 (12) : 1445 50 加上与 T7 启动子引物 5-CCTGTCTC-3互补的 8 nt 序列。正反义模板的总长度为 29 nt。本实验从设 计的 3 条序列中选出了一条作用较强的序列 (预实 验证实) 作为靶序列, 其正反义模板的序列如下: 反 义 5-AACTGGGGGAGGATTGTGGCCCCTGTCTC-3, 正 义 5-A
11、AGGCCACAATCCTCCCCCAGCCTGTCTC- 3; 错配序列的模板为: 反义 5-AACTGTAGGAG- GATTGTGGCCCCTGTCTC-3 正 义5-AAGGCCA- CAATCCTCCTACAGCCTGTCTC-3, 化学合成 siRNA 按 siRNA 构建试剂盒说明书进行。 1. 3 siRNA 的鉴定 每一反应产物进行 20 gL -1 的琼脂糖凝胶电泳。各组上样剂量分别为: 未消化 的 dsRNA 2 l, 已消化的 siRNA 5 l, 消化并纯化的 siRNA 10 l。siRNA 的定量用 TE (pH 8. 0) 液以 1 : 250 浓度稀释 siR
12、NA, 用紫外分光光度计测定其 A260吸光度值, 根据吸光度值计算 siRNA 浓度, 并将 浓度调整至 20 molL -1。 1. 4 Cy3 荧光标记 Bcl-2 siRNA 取20 molL -1 的 siRNA 19. 2 l 于无核酶 EP 管中, 并向其中加入 无核酶水及标记缓冲液, 最后加入 Cy3 标记试剂。 充分混合各成分, 置于 37避光反应 1 h。将反应 物10 000 rmin -1离心 20 min, 轻轻吸出上层液体。 加入体积分数为 70% 乙醇轻轻振荡, 10 000 r min -1离心 5 min, 小心去除上层液体, 室温放置 5 min 左右晾干。
13、加入 19. 2 l 无核酶水重悬 siRNA, 获得 Cy3 标记的 siRNA 溶液。 1. 5 细胞培养及实验分组 细胞培养于含 10% 的 灭活胎牛血清的 DMEM 培养液中, 置 37、 5% CO2、 饱和湿度的培养箱中培养。实验分 5 组: 空白 对照组,转染液中无 siRNA; 阴性对照组,阴性 GAPDH siRNA; 阳性对照组, 阳性 GAPDH siRNA; Bcl-2 实验组,加入 Bcl-2 siRNA; Bcl-2 错配组, 错配 位点的 bcl-2 siRNA。实验均用对数生长期细胞。 1. 6 细胞生长状况的分析 离心收集的细胞重悬 于无血清及抗生素的 DME
14、M 培养液中, 接种于 96 孔细胞培养板中, 每孔 80 l (细胞终浓度为 1 106 个L -1) 。稀释 2 l siPORT Lipid 至 47 l Opt1- MEM1 中, 充分混匀室温放置 20 30 min, 加入 siR- NA (20 molL -1) 再室温放置 15 20 min 即得 siRNA/ siPORT Lipid 复合物。向培养板孔中加入终 浓度为 20 nmolL -1 的 siRNA/ siPORT Lipid 复合 物, 每一浓度接种 4 个孔, 对照组不加 siRNA, 其余 同实验组。培养箱孵育 4 h 后加入含 10% FBS 的 DMEM
15、培养液继续孵育, 于转染 48 h 后先在倒置普 通光学显微镜下观察细胞形态并拍照。然后各孔加 入 20 l MTT (5 gL -1) 。继续孵育 4 h, 将培养板 800 rmin -1离心 8 min 弃去上清。每孔快速加入 二甲基亚砜 (DMSO) 150 l, 前后轻轻晃动培养板混 匀, 10 min 后用酶标仪测 A490。 1. 7 荧光显微镜观察细胞凋亡和 Bcl-2 蛋白水平 细胞培养及处理方法同方法1. 5。转染48 h 后收 集各组细胞, PBS 洗涤 2 遍, 甲醇/ 冰乙酸 (3: 1) 室 温固定 20 min 离心并用 PBS 洗涤 2 遍, 加入 600 l
16、透膜剂 (5% DMSO, 0. 25% Triton X-100) 37 作用 20 min, 加入 FITC 标记的 bcl-2 单抗, 37避光孵育 30 min, PBS 洗涤; 加入 GAPDH 一抗, 37 孵育 30 min, PBS 洗涤 2 遍, 再加入 PRE 标记的 GAPDH 二 抗, 用 2%多聚甲醛重悬细胞, 用荧光显微镜测细胞 凋亡和蛋白表达水平。 1. 8 逆转录聚合酶链反应检测 Bcl-2 mRNA 细 胞培养及处理方法同方法 1. 5。离心收集细胞, 按 GIBCO 公司的 Trizol 试剂盒说明, 一步法提取各组 细胞总 RNA。逆转录反应按 Prome
17、ga 公司说明书的 方法完成。扩增 Bcl-2 引物序列为: 上游 5-CGA CGA CTT CTC CCG CCG CTA CCGC-3和下游 5- CCG CAT GCT GGG GCC GTA CAG TTCC-3, 扩增 片段长度为 318 bp; 扩增 GAPDH 的引物序列为: 上 游 5-TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG-3和下游 5-TGT CGC TGT TGA AGT CAG AG-3, 扩增片段长 度为 697 bp; 内参照为 -action,扩增引物序列为: 上游5-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3和下游 5-CTC C
18、TT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3, 扩增 片段长度为 548 bp。PCR 反应条件是: 94预变性 5 min, 循环参数为: 94 1 min, 64 1 min, 72 1 min, Bcl-2 32 个循环,GAPDH 和 -action 28 个循 环。PCR 产物经 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像 分析系统观察并扫描记录图像。以 bcl-2、 GAPDH 与 -action 的灰度比值代表 Bcl-2、 GAPDH 的相对 灰度值进行统计学方法分析。 1.9 Hoechst 33258 染色观察细胞形态的变化 细 胞培养及处理方法同方法 1. 5。离
19、心收集细胞, PBS 洗涤后甲醇/ 冰乙酸固定15 min, 离心弃上层液体保 留约 50 l 液体, 重悬细胞, 滴加至干净载玻片上, 加 0. 5 ml Hoechst 33258 染色液, 染色 5 min。用吸 水纸从边缘吸去液体, 微晾干。滴一滴抗荧光淬灭 封片液于载玻片上, 盖玻片封片。荧光显微镜观察 细胞核的形态。 1. 10 统计学处理 实验数据采用-x s 表示, 用 SPSS 10. 0 进行统计处理, 统计学方法采用 t 检验。 2 结果 6441中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec; 21 (12) 2. 1
20、 体外转录合成的 Bcl-2 siRNA 长度及剂量的 鉴定 凝胶电泳结果显示, 未消化的反应物在约 31 bp 处有一条主要的条带。消化的反应物在21 bp 处 产生一条带, 其密度小于未消化的带。柱状纯化的 产物同样在 21bp 处有一条带, 且其密度大于已经消 化产物的 50% (Fig 1) 。 Fig 1 Identification of Bcl-2 siRNA using gel electrophoresis Marker: 100 bp DNA Ladder including 21 bp standard siRNA,1: not digest reaction; 2:pu
21、rified reaction; 3:digest reaction 2. 2 Cy3 荧光标记的 Bcl-2 siRNA 的鉴定 20% 的聚丙烯酰胺分离胶电泳结果显示已标记及未标记 上 Cy3 荧光素的两种 Bcl-2siRNA (见 Fig 2) 。 Fig 2 Identification of Bcl-2siRNA labeled Cy3 using gel electrophoresis 1: unlabeled-Cy3 Bcl-2siRNA; 2: labeled-Cy3 Bcl-2 siRNA 2. 3 siPORT Lipid 转染试剂转染 Cy3 荧光标记的 Bcl-2 s
22、iRNA 的结果鉴定 荧光显微镜可见 Cy3 荧 光标记的 Bcl-2 siRNA 已成功转入 HL-60 细胞 (见 Fig 3) 。 Fig 3 The situation of HL60 cells transferred with siRNA labeled Cy3 ( 40) 2. 4 Bcl-2 siRNA 对 HL-60 细胞生长状况的影响 各种 siRNA 转染细胞4 h 后, 20 nmolL -1浓度组 均开始出现对细胞明显的抑制作用, 细胞出现碎裂 现象, 且细胞碎裂程度与转染 siRNA 的浓度有关, 不同 siRNA 及不同 siRNA 浓度对细胞生长的影响 不同。与
23、空白对照组, Bcl-2 siRNA 及其错配位点均 可抑制 HL-60 细胞的增殖生长, 而 10 nmolL -1 GAPDH siRNA 对细胞生长影响不明显, 但 40 nmol L -1则较明显。Bcl-2 siRNA 组可见 HL-60 细胞生 长密度减小, 细胞出现碎裂死亡现象。故在以后的 实验中转染 siRNA 终浓度用10 nmolL -1。结果如 Tab 1 所示。 Tab 1 Effects of Bcl-2 siRNA on cell activity in HL-60 cells (-x s, n =4) Group Absorbency/ nmolL -1 1020
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