BTLA介导的负调共刺激信号对混合淋巴细胞反应抑制的研究.pdf
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1、论 著 B T L A介导的负调共刺激信号对混合淋巴细胞反应抑制的研究 * 冯嘉瑜1, 宋 波1, 张艮甫2, 黄赤兵2, 王平贤2, 范明齐2, 肖 亚2, 贾维胜2, 方针强2 ( 1.第三军医大学西南医院泌尿外科, 重庆4 0 0 0 3 8;2.第三军医大学新桥医院泌尿外科, 重庆4 0 0 0 3 7) 摘 要: 目的 HV EM基因突变体腺病毒载体对大鼠混合淋巴细胞反应(ML R) 的影响。方法 R T - P C R获得人HV EM的 c D NA, 使其与L I GHT分子结合的表位点突变, 保留与B T L A结合的关健位点。构建经修饰的HV EM基因的复制缺陷型腺病毒 载体
2、A d v - mHV EM - I R E S 2 - E G F P并对其进行鉴定和转染效率测定。将该载体用于混合淋巴细胞反应中, 观察对淋巴细胞增殖的 影响。结果 成功构建HV EM突变体和E G F P复制缺陷型腺病毒载体, 经过测序与预期一致, 体外培养细胞转染效率达到9 5% 以上。该载体能够对大鼠ML R有明细的抑制作用。结论 构建的腺病毒载体能够共表达目的基因的产物HV EM突变体和 E G F P蛋白, 对体外细胞具有高效转染能力。该载体能够对大鼠混合淋巴细胞反应有明显的抑制作用。 关键词: 共刺激信号;HV EM; 突变体;B T L A; 腺病毒表达载体 中图分类号:Q
3、2 6文献标识码:A文章编号: 1 6 7 1 - 8 3 4 8(2 0 0 6)1 5 - 1 3 6 6 - 0 3 C o n s t r u c t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no fA d v - mH V EM - I R E S 2 - E G F P F ENGJ i a - y u,ZHANGG e n - f u,HU ANGC h i - b i n g,e t a l. (1.D e p a r t m e n t o fU r o l o g y,S o u t h w e s tH o s p i t a l,T h
4、 i r dM i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y,C h o n g q i n g4 0 0 0 3 8,C h i n a; 2.D e p a r t m e n t o fU r o l o g y,X i n q i a oH o s p i t a l,T h i r dM i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y,C h o n g q i n g4 0 0 0 3 7,C h i n a) A b s t r a c t:O b j e c t i v e T oo b
5、s e r v et h ee f f i c a c yo fHV EM g e n eA d vv e c t o ri nm i x e dl y m p h o c y t er e a c t i o n(ML R). M e t h o d s HV EMc D NAb i n dd o m a i no fL I GHTw a sm u t a t e db yR T - P C Ra n dP C R. A d e n o v i r u s e x p r e s s i o nv e c t o rA d v - mHV EM - I R E S 2 - E G - F P
6、w a sc o n s t r u c t e dw i t hmHV EMa n dE G F Pb ym e a n so fA D - E a s ys y s t e m. T h ev e c t o rw a s i d e n t i f i e da n de v a l u a t e dt h ee f f i c i e n c y o f t r a n s f e c t i o n . T h ea d e n o v i r u sv e c t o rw a su s e d i nm i x e dl y m p h o c y t er e a c t i
7、 o n(ML R). R e s u l t s HV EMa n dE G F Pw e r ee x p r e s s e d i nt h e c u l t u r e c e l l s t r a n s f e c t e db y t h ev e c t o rw i t ha t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo v e r 9 5%.MR Lc o u l db e i n h i b i t e db y t h e a d e n o v i r u sv e c - t o r . C o n c l u s i
8、 o n T h er e c o m b i n a t ev e c t o rA d v - mHV EM - I R E S 2 - E G F Pc o u l de x p r e s s t h ep r o t e i no fmHV EMa n dE G F Pi nc e l l l i n e w i t hh i g ht r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y .MR Lc o u l db e i n h i b i t e db yt h ea d e n o v i r u sv e c t o r . K e yw o
9、 r d s:c o - s t i m u l a t o r ys i g n a l s;HV EM;m u t a n t;B T L A;a d e n o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o r 在移植免疫中,T细胞的需要MHC -抗原肽- T C R提供的 第1刺激信号和共刺激分子提供的共刺激信号方能激活, 二者 缺一不可。近年来对共刺激分子的研究发现, 共刺激信号不仅 有提供正性共刺激信号的分子( 如:C D 2 8 - B 7、C D 4 0 - C D 1 5 4) , 也有提供负性共刺激信号的分子(C T L A 4 - B 7、P
10、 D 1 - P D 1 L、B T - L A - HV EM其中 后2个 分 子 均 是 在 近 年 来 得 到 克 隆 和 鉴 定) 1。HV EM属于 TN F受体超家族的成员, 它扮演一个双 相调节T细胞激活的角色, 通过L I GHT配体提供给T细胞一 个阳性信号 2, 通过 I g 超家族的B T L A提供给T细胞一个抑制 性信号 3, 通过竞争性结合分析和突变显示了B T L A与 HV EM 结合的位点在HV EM的C R D 1去的酪氨酸残基上 3,4。B T L A 在HV EM上的结合位点是保守的TN F R - U L 1 4 4区, 出现在人 类的巨细胞病毒(CM
11、V) 中,U L 1 4 4只与B T L A结合而不和 L I GHT结合, 并抑制T细胞的激活 5。本研究拟对 HV EM 的L I GHT结合区进行点突变, 使其仅与B T L A结合, 达到抑 制T细胞增殖的作用。将经过修饰的HV EM和E G F P构建 到复制缺陷型腺病毒表达载体中, 用于后期观察该分子对负调 共刺激信号的激活作用。 1 材料与方法 1. 1 主要试剂 各种限制性内切酶, T 4D NA聚合酶、T a q D NA聚合酶、R T - P C R试剂盒购自R O CHE公司。P C R产物 试剂盒、 小量质粒提取试剂盒、 琼脂糖凝胶回收试剂盒、D NA 快速连接试剂盒
12、、T a K a R aM u t a n B E S T K i t购自宝生物公司。 脂质体转染试剂盒L i p o f e c t i nR e a g e n t购自I n v i t r o g e n公司, A d E a s yX LA d e n o v i r a lV e c t o rS y s t e m试剂盒购自S t r a t a g e n e 公司。 1. 2 质粒及抗体 p G EM T - E a s y质粒购自美国P r o m a g a公 司, p U C 1 8、p U C 1 9购自宝生物公司, p I R E S 2 - E G F P(C l
13、o n t e c h 公司) 质粒由第三军医大学西南医院烧伤研究所贺伟峰博士惠 赠,HV EM质 粒 购 自A T C C(A T C C N u m b e r、MG C - 3 7 5 3) , HV EM(CW 1 0)P E抗体购自S a n t aC r u z公司。 1. 3 菌株及细胞株 大肠杆菌J M 1 0 9由第三军医大学西南 医院烧伤研究所提供, 2 9 3细胞株、P K 1 5细胞株由第三军医大 学西南医院烧伤研究所提供。 1. 4 方法 1. 4. 1 通过P C R方法扩增HV EMc D NA片断, 扩增的c D - NA连接 到p G EM T - E a s
14、 y质 粒 中 进 行 大 量 扩 增。按 照 文 献 3,6中介绍的氨基酸残基位点对 HV EM的L I GHT结合区 进行点突变, 突变采用T a K a R aM u t a n B E S TK i t试剂盒进行。 得到的mHV EM( 突变后的HV EM) 片断与p I R E S 2 - E G F P质 粒连接, 连接后得到p mHV EM - I R E S 2 - E G F P, 同时转DH 5 感 受态菌株进行扩增、 酶切和电泳鉴定。S a l I酶切得到的mH - 6631 重庆医学2 0 0 6年8月第3 5卷第1 5期 * 基金项目: 国家自然科学基金资助项目(3
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- 关 键 词:
- BTLA 负调共 刺激 信号 混合 淋巴细胞 反应 抑制 研究
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