CD4CD25调节性T细胞的发育与胸腺CD4CD25细胞关联性的探讨.pdf
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1、 1 4 0 6中国病理生理杂志2 1 ( 7 )1 4 1 0 文章编号 1 0 0 ( ) 一 4 7 1 8 ( 2 0 0 5 ) 0 7 一 1 4 0 6 一 0 5 C D 4 + C D 2 5 + 调节性 T细胞的发育与胸腺 C D 4 一 C D 2 5 + 细胞关联性的探讨 肇静娴, 曾耀英。 ( 暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室, 广东 广州5 1 0 6 3 2 ) 摘 要 目 的: 探讨C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞( C D 4 + C D 2 5 十 , g u l a to ry T c e ll s , C D 4 十 C D 2
2、5 十 T r ) 的 发育及其与 胸腺C D 4 - C D 2 5 + 细胞的关系。 方法: 以流式细胞术检测小鼠 从出生至发育成熟过程中, 胸腺、 脾脏、 淋巴 结和外周血 中C D 4 + C D 2 5 + T r 比例变化, 以及胸腺C D 4 - C D 2 5 + 细胞比例变化; 通过磁激活细胞分选( M A C S ) 从小鼠淋巴结纯化 C D 4 + C D 2 5 + T 和C D 4 + C D 2 5 一 T 细胞, 经C F D A 一 S E 标记, 以多种刺激形式诱导增殖。 结果: 小鼠出生 1 d 到 1 0 周的 发育过程中, 胸腺C D 4 + C D 2
3、 5 十 T r 比例一直比较恒定, 但在脾脏、 淋巴结和外周血, 随鼠龄增加而不断升高, 从1 d 龄 到 1 周时升高最迅速, 其后的升高速度逐渐减慢, 1 0 周龄时达平台期。胸腺中C D 4 - C D 2 5 + 细胞在出生 1 d 的小鼠比 例非常高, l d 龄到1 周龄期间迅速下降, 1 0 周龄时达平台 期。C o n A 不能诱导C D 4 + C D 2 5 + T r 和C D 4 + C D 2 5 一 T 细胞 增殖, 但C D 4 + C D 2 5 + T r 出现一过性细胞增大; 佛波醇醋加离子霉素能诱导 C D 4 十 C D 2 5 + T r 和C D
4、4 + C D 2 5 一 T 细胞增 殖; 包被的抗C D 3 抗体加可溶性抗C D 2 8 抗体能刺激C D 4 C D 2 5 一 T 细胞增殖, 但C D 4 十 C D 2 5 十 T r 不增殖, 加入高浓度 I L 一 2 , C D 4 十 C D 2 5 一 T 细胞增殖更强, C D 4 C D 2 5 T r 出现增殖。 结论: 胸腺 C D 4 - C D 2 5 + 细胞很有可能是 C D 4 C D 2 5 十 T r 的前体。 关键词 C D 4 C D 2 5 十 调节性T 细胞; 胸腺; C D 4 - C D 2 5 + 细胞 【 中图分类号 8 3 9 2
5、 . 1 2 文献标识码 A A s s o c i a t i o n b e t w e e n d e v e l o p m e n t o f C D 4 + C D 2 5 + r e g u l a t o r y T c e l l s a n d t h y - mu s C D 4 一 C D 2 5 +c e l l s Z H A O J in g 一 x i a n , Z E N G Y a o 一 y i n g ( T h e K e y L a b o r a t o r y of M in is t r y of E d u c a t io n f o r
6、 T is s u e T r a n sp la n t a t io n T h y m u s g l a n d ; C D 4 一 C D 2 5 + c e ll s 收稿日 期 2 0 0 5 - 0 4 - 1 4 修回日 期 2 0 0 5 - 0 5 - 2 9 * 基金项目 国家“ 9 7 3 ” 项目( N o . 2 0 0 4 C B 7 2 0 1 0 0 ) ; 国家自 然科学基金重点项目( N o . 3 9 9 3 0 2 3 0 ) ; 暨南大学引进优秀 人才科研启动基金资助项目 ( N o . 5 1 2 0 4 0 6 5 ) 通讯作者T e l :
7、0 2 0 一 8 5 2 2 0 7 3 2 ; E 一 二1 : y a o y i n g z e n g 1 2 6 . c o rn 1 4 0 7 C D 4 + C D 2 5 十 T r 是一群具有组成性免疫抑制活性 的T 细 胞亚群, 1 9 9 5 年由S a k a g u c h i 等 首次报道。 现已证明, C D 4 + C D 2 5 + T r 参与抑制抗原特异性的 C D 4 + T 和C D 8 + T 细胞的免疫应答, 这些应答可以是 针对自 身抗原、 肿瘤抗原、 同种异基因移植抗原, 以 及包括寄生虫、 细菌、 病毒抗原在内的感染性病原体 抗原。目 前
8、普遍认为C D 4 十 C D 2 5 + T r 起源于胸腺, 主 要证据是, 小鼠出生3 d内切除胸腺, 成熟后外周无 C D 4 + C D 2 5 + T 细胞, 并患自 身免疫性疾病。然而, 迄 今为止对自然出现的 C D 4 + C D 2 5 + T r 的发育还知之 甚少, 有研究推测是胸腺中C D 4 十 T 细胞受到中等强 度的抗原刺激, 活化后表达C D 2 5 分子并获得抑制性 调节活性 2 l , 亦有学者通过转基因 小鼠 实验推测, 自 然出现的C D 4 + C D 2 5 + T 细胞很可能是来自“ 内置了 抑制性程序的 特殊谱系” ” , 但并未发现任何相关的
9、 前体细胞, C D 4 十 C D 2 5 + T r 的起源和发育成为该领域 研究的重要课题。本研究将系统观察小鼠成长发育 过程中, 中枢及外周淋巴器官C D 4 十 C D 2 5 + T r 的变化 规律, 并探讨 C D 4 + C D 2 5 + T r 发育与胸腺 C D 4 - C D 2 5 + T的关联性。 材料和方法 1 主要试剂和仪器 荧光标记的抗小鼠C D 3 , C D 4 , C D 2 5 单克隆抗 体, 以及纯化的无叠氮钠/ 低内毒素抗小鼠 C D 3 , C D 2 8 单克隆抗体均购自 美国B D P h a r M i n g e n 公司; 小 C D
10、 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞分离试剂盒购自 德国 l t e n y i B io t e c 公司; V y b r a n t TM C F D A S E C e l l T r a c e r K it 胸腺、 脾脏、 淋巴结( 腋窝和腹股沟淋巴结) , 并制成 单细胞悬液, 悬浮于P B S 。其中出生 1 d 的小鼠淋巴 结太小, 没有取材; 脾细胞经裂解法去除红细胞。 4 抗体标记 ( 1 ) 全血抗体标记: 取抗凝全血5 0 u L , 加人抗小 鼠C D 3 , C D 4 和C D 2 5 单克隆抗体, 混匀, 室温避光放 置2 0 m i n 。加人3 7
11、预热的红细胞裂解液2 m L , 作 用5 m in 后离心洗涤1 次, 4 0 0 汕P B S 悬浮, 立即 用流 式细胞仪进行检测。( 2 ) 胸腺细胞、 脾细胞和淋巴结 细 胞抗体标记: 调整细胞悬液的密度至 1 x 1 0 10 c e l l s / L , 取8 0 匹细胞悬液加人抗小鼠C D 3 , C D 4 和 C D 2 5 单克隆抗体, 混匀后室温避光放置2 0 m in , 离心 洗涤1 次, P B S 悬浮, 立即用流式细胞仪进行检测。 5 C D 4 十 C D 2 5 十 T r 的纯化 按小鼠 C D 4 十 C D 2 5 + 调节性 T 细胞分离试剂盒
12、说明书, M A C S 法先负选获得C D 4 + T 细胞, 再正选获 得 C D 4 + C D 2 5 + T 细胞。 6 C F D A一 S E染色检测细胞增殖 4 1 二乙 酞梭基荧光素一 唬拍酞亚胺醋( c a r b o x 州 u o - r e s c e i n d i a c e t a t e , s u c c i n i m i d y l e s t e r , C F D A一 S E ) , 是一 种活细胞染料, 进人细胞内被醋酶切割成 US E 。当 细胞分裂时, C F S E 标记物平均分配到两个子代细胞 中, 因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样,
13、 在一 个增殖的细胞群中, 各连续代细胞以荧光强度的2 倍递减为特征, 并且能够利用流式细胞术在4 8 8 r u n 激发光和F L l ( 荧光 1 ) 检测通道进行分析。C F D A- S E 用 D M S O溶解成 1 0 m m o l/ L 的储存液, 一 2 0保 存。临 用前, 取适量用P B S 稀释成1 N .m o U L 的工作 液, 平衡至室温备用。2 x 1 0 10 c e l l s / L 的细胞悬液中 加人等体积的C F D A 一 S E 工作液( 终浓度为1 p m o l y L ) , 充分混匀后3 7 水浴作用 1 0 m i n , 并轻轻振
14、荡。 用5 m L含 5 %胎牛血清的R P M I 一1 6 4 ( ) 培养液终止 染色, 并离心洗涤细胞2 次, 最后以含1 0 %胎牛血清 的R P M I 一 1 6 4 0 完全培养液悬浮。 7 多克隆刺激剂诱导 C D 4 十 C D 2 5 + T细胞增殖 纯化的 C D 4 + C D 2 5 + T细胞和 C D 4 + C D 2 5 - T细 胞经C F D A 一 S E 染色后以R P M I 一 1 6 4 0 完全培养液悬 浮成2 x 1 0 9 c e l l s / L , 在%孔板中培养, 每孔2 0 0 fi L , 经以下4 种形式刺激4 8 h 后,
15、 用流式细胞仪检测细 胞增殖: 佛波醇醋类多克隆刺激剂P D B ( 终浓度 0 . 2 p m o U L ) 加钙离子转运剂io n o m y c in ( 1 m g / L ) ; ( 2 植物血凝素类多克隆刺激剂C o n A ( 5 m g / L ) ; %孔 板包被纯化的 抗小鼠C D 3 单克隆抗体( 1 0 m g / L ) , 并 加入可溶性纯化的抗C D 2 8 抗体( 1 0 m g / L ) ; 板包 鼠Mi ( C - 1 2 8 8 3 ) 购自 美国M o l e c u l a r P r o b e s 公司; 刀豆蛋白 A ( C o n A )
16、、 佛波醇醋( P h o r b o l 1 2 , 1 3一d i b u t y r a t e , P D B ) 、 离子霉素( io n o m y c in ) 和白 细 胞介素2 ( I L 一 2 ) 均购自 美国S i g m a 公司。F A C S C a l ib u r 流式细胞仪为 美国B e c t o n D ic k in s o n 公司产品; 磁激活细胞分选系 统为德国M il t e n y i B io t e c 公司 产品。 2 实验动物 S P F 级B A L B / c J 近交系小鼠, 购自 北京维通利华 公司( 原北京实验动物中心) ,
17、 在暨南大学医学院病 理教研室免疫缺陷动物室饲养、 繁殖。精确计算小 鼠出生天数, 取出生 1 d , I 周、 4 周、 1 0 周和2 0 周的 小鼠进行实验, 雌雄随机。 3 取材 ( 1 ) 血液: 由于出生1 d 和1 周的小鼠 体积很小, 其它方式不易采集到所需血量, 因此均采用心脏穿 刺法取血, 以肝素钠( 2 5 x 1 0 3 U / L ) 抗凝。( 2 ) 常规取 1 4 0 8 被的 抗C D 3 抗体加可溶性纯化的抗C D 2 8 抗体, 同时 加I L 一 2 ( 4 x 1 0 5 U / L ) 。 8 统计学处理 获得的数据用x 土 、 表示, n 为样本量。
18、统计作 图 软件用M i c ro s o f t E x c e l 和O r ig in 7 . 0 p ro f e s s io n a l 。 统 计方法用 t 检验。 结果 均无明显增殖, 但前者在刺激 1 6 h 时见细胞增大, 胞 浆增多, 细胞变亮, 4 8 h 细胞又恢复至原来大小, 无 集落形成, 细胞间US E 染色均一性变差; 而后者细 胞未见有明显形态学改变, US E 染色仍保持良 好均 一 性。 P D B + i o n o m y c i n 刺激4 8 h 后均出现增殖。 包 被的a n t i 一 C D 3 + 加可溶性a n t i 一 C D 2
19、8 抗体共同刺激 4 8 h 后, C D 4 + C D 2 5 + T r 未发生增殖, 而 C D 4 + C D 2 5 一 T 细 胞发生明显增殖; 若同时加人 I L 一 2 4 x 1 0 5 U / L , C D 4 十 C D 2 5 + T r 出现增殖, C D 4 十 C D 2 5 - T 细胞的增殖 更强( 图4 ) 0 C叫 尸 - - - reses es - - 一 - C )闷a A 7 I 0 / I c 匀 刁 _ 了犷 11.1 C 二月,. : 叭. :. 日书1 -T,一 刁 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 FLl 一 H 一 Lym
20、ph node8.9% o尝尸甲鲜,外 r曰 1 0 “ 1 0 0 - 1 0 1 0 属.寸,I妈 工.寸、1叭 C 一一 厂S p l e e n c : 一1 0 . 7 7 % , PI C 二 - .iykt.:co- -o -10 10 102 104 工叶闷妈 FL1 - H 口1叶曰山 的叫OU 1 小鼠不同发育阶段中枢及外周淋巴器官 C I A + C D 2 5 + 1 r的分布 正常成年小鼠( 1 0 一 2 0 周龄) 各淋巴器官及外周 血C D 4 + C D 2 5 + T 占C D 4 + T 细胞比 例, 平均由 低到高 依次是胸腺( 4 %) 、 外周血(
21、6 %) , 淋巴结( 8 %) 和脾 脏( 1 1 %) 。出生 l d 到2 0 周的小鼠, 胸腺中C D 4 十 C D 2 5 + T细胞百分率无明显变化( P 0 . 0 5 ) , 均为 3 %一6 %; 1 d 龄的小鼠, 脾脏和外周血中C D 4 + C D 2 5 十 T 细胞比例 0 . 0 5 ) ( 图1 , 2 ) 。 T h y m u s F L1 - H F Ll 一 H CD4 F i g 2 R a ti o s o f C D 4 + C D 2 5 十 T r t o C D 4 + T c e ll s i n th y m u s , b l o o
22、 d , l y m p h n o d e a n d s p l e e n o f t h e s a m e 1 0 w e e k s o l d m o u s e . 图2 同 1 只小鼠( 1 0周) 胸腺、 外周血、 淋巴结和脾脏中 C D 4 十 C D 2 5 + T r 占C D 4 + T细胞的比例 3 小鼠不同发育阶段胸腺 C D 4 - C D 2 5 + 细胞的变化 如图2 所示, 我们注意到 1 0 周龄小鼠胸腺中有 一群C D 4 - C D 2 5 h ig h 的细胞, 而脾脏、 淋巴结和外周血 中均不存在这样一群细胞, 遂对小鼠不同发育阶段 胸腺 C
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- CD4CD25 调节 细胞 发育 胸腺 关联性 探讨
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