EVANS蓝用于鼠皮肤炎症反应损害程度的量化分析.pdf
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1、中国病理生理杂志2 1 ( 8 ) 1 6 2 7 1 6 2 5 文章编号 1 0 0 ( ) 一 4 7 1 8 ( 2 0 0 5 ) 0 8 一1 6 2 5 一 0 3 E v a n s 蓝用于鼠皮肤炎症反应损害程度的量化分析 杨红玲, , 唐雯 “ , 冯琼, , 陈劲松 ( 广州市妇婴医院检验科, 广东 广州 5 1 0 1 8 0 ; “ 中山医科大学附属第一医院浦院区儿科, 广东 广州 5 1 070 0 ) 摘 要 目的: 利用E v a n s 蓝对由 组胺和神经肤P 物质引起的局部皮肤炎症损害、 渗出, 进行量化分析。方 法: 从B a lb / c 鼠 尾静脉注射标
2、定浓度的E v a n s 蓝1 0 0 沙, 麻醉后在脊背局部皮内 分别注射2 0 匹组胺、 神经肤物质P 及生理盐水, 1 5 m in 后处死动物, 切下反应皮肤区, 取约1 c m x 1 C m x 1 。组织放人6 0 0 匹二甲 酞胺溶液的小瓶中 保 存。 实 验时取出 组织5 5 C 避光 孵育2 4 h , 取2 0 0 沙孵化液 用分光光度计进行测定, 测量渗出的E v a n s 蓝的吸光 度 进行定量分析。 结果: E v a n s 蓝注 射后5 m i n 给予 组胺3 . 0 W0.2 c m z 诱导效果最佳, 可得到最大的E v a n s 蓝吸光 度。E v
3、 a n s 蓝注射后1 0 m in , 给予0 . 1 p g / 0 . 2 。 衬神经肤P 物质可得到最大的E v a n s 蓝吸光度。E v a n s 蓝在0 . 3 1 2 - 1 0 0 m g / L 浓度范围内 与吸光度呈线性关系。结论: E v a n s 蓝可用于由 组胺和神经肤P 物质诱导的鼠局部皮肤炎症 损害渗出的定量监测分析, 所建立的评估超敏反应程度的方法简单、 敏感且可定量。 关键词 伊文思蓝; 组胺; 神经肤P ; 炎症; 皮肤 K E YWO R D S E v a n s b lu e ; H is ta m i n e ; N e u r o p e
4、 p t id e P ; I n fl a m m a t io n ; S k i n 【 中图分类号 8 3 6 3 文献标识码 A 皮肤是机体最易观察炎性反应及进行相关药物筛选的 器官, 但皮肤炎性反应量化检测研究较少。常见的皮肤炎性 反 应 模 式 有3 种 : 反向 被 动 阿 图 斯 反 应( re v e r s e p a s s iv e a r th u s re a c t io n , R P A R ) 、 被动皮肤过敏反应( p a s s i v e c u t a n e o u s a n a p h y - l a x i s , P C A ) 和组胺介
5、导的炎性反应( h i s t a m i n e 一 in d u c e d in fl a m - m a t o r y , H l ) 。 虽然R P A R可通过皮肤损伤部位水含量而检 测, P C A 通过观察 E v a n s 蓝的渗透而检测, H I 反应通过水容 量和核素标记血清蛋白渗透而检测, 但这些方法不适于标准 化和大批样本的检测, 而对皮肤炎性反应程度的评估, 需要 一简单、 敏感且可定量的方法来检测皮肤炎性反应的程度, 为此我们对皮肤炎性反应的量化检测进行研究。 材料和方法 1 动物和材料 B a l b / C ( H 一 2 d ) 鼠购于第一军医大学动物实
6、验中心。雌 性, 8 周龄, 重约1 9 一 2 1 g , 动物级别为一级, 所有小鼠 均饲养 于相同的环境中。组胺( H一 7 2 5 0 ) 、 神经肤 P 物质( S P 一 6 8 8 3 ) 和E v a n s b l u e ( E B ) ( E 一 2 1 2 9 ) 购于S ig m a 公司。 分光光度计为 日 本岛津 U V - 2 1 0 型紫外分光光度计。 2 皮肤炎症反应模型的建立 在鼠脊背部备皮约 1 . 5 c m x 3 c m的区域, 用于炎症反应 的 诱导。 从鼠尾静脉注射1 0 0 沁 E B 溶液后, 立即喂服0 . 2 M L 1 0 %水合氯醛
7、麻醉, 放回笼中5 m i n 后, 在鼠背部备皮区分 别双份注射2 0 tt L H I / 孙及生理盐水, 随后在皮肤刺激区出 现水泡反应( E B 渗漏) , 1 5 m i n 后处死大鼠, 手术切除背部皮 肤。 收稿日 期】 2 0 0 3 - 1 0 - 2 8 修回日 期 2 0 0 4 - 0 2 - 0 4 T e l : 0 2 0 一8 8 4 9 4 6 1 3 3 E v a n 蓝渗出的定A分析 将切下的皮肤皮毛侧向下放在木板上, 标记出诱导部位 的蓝色水泡区。在蓝色水泡区取约I c mxI c mx l c m的组织 放人6 0 0 (1 L 二甲酞胺的小瓶中,
8、检测时将标本从瓶中取出 5 5 避光孵育2 4 h , 经0 . 2 2 y m的微旋转尼龙过滤器高速离 心5 m in , 以去除液体中的其它碎片。取2 0 0 匹孵化液并充分 混匀, 用分光光度计6 1 0 n m的波长, 测量渗出的E B吸光度。 每测一管, 校正“ 0 ” 点一次, 用水做空白, 定 1 0 0 %T 。根据已 知浓度的E B 标准品的含量计算其敏感度, 同时以6 1 0 r u n 分 光光度计测定 E B 的A值为纵坐标, E B 浓度为横坐标绘制标 准曲线, 得出线性范围。从而计算出E B 渗出的浓度。 4 统计学处理 对至少6 次重复试验的数据求平均值土 标准差
9、, 单因素 方差分析用于结果统计, 对照组和试验组之间及各试验组之 间采用 t 检验。 结果 1 E v a n 蓝吸光度的检测敏感性 用分光光度计检测出皮肤炎症反应引起的E B 渗出的改 变, 对E B 进行定量测定。空白对照生理盐水的吸光度小于 0 . 0 8 。 本法测定的E B 下线为0 . 3 1 2 m g / L , E B 在浓度范围在 0 . 3 1 2 一 1 0 0 m g / L 内与吸光度线性关系较好( 图1 ) 0 2 皮肤炎症反应诱导中, H 1 , S P , E v a n s 蓝最佳浓度的选择 2 . 1 E v a n s 蓝最佳浓度的选择对用量浓度为 0
10、 . 1 % - 1 . 0 %E B 溶液进行试验比较其标准差的变异。取每个浓度8 只鼠, 用1 0 % 水合氯醛0 . 2 m L 麻醉( ip ) B a l b / c 鼠E ( 2 0 1 1 ) g 1 6 2 6 后, 于 尾静 脉分别注射浓度为0 . 1 %, 0 . 2 5 %, 0 . 5 %, 1 . 0 %的度。 0 . 0 3 , 0 . 1 , 0 . 3 tL g , 不同 时间 方差分析: P 0 . 0 5 , 即 的A值对诱导部位 E B 渗出进行定量测定。3 种浓度在 1 0 m i n 时的吸光度无显著差别。 0 . 3 0 、n钊 ,一,一 : .1.
11、W5谕二0州 。祠一5谕二0闪 。15锄二哟一 。1一的谕二0一 。倒一的/助二喻 。1一5/切二仍 。15/训二一 。1.W5锄连仍6 。u一一心叻 0 . 1 5 0 . 1 0 0 . 0 5 0 。豁毛05召山山 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 C o n c e n t r a t i o n o f E v a n s b l u e ( m g / L ) 八UgQO,16亡、4,J,10we 10八UnUOCU00八Iln“ 。0易eo仍q招国国 F i g 1 图 1 F i g 2 T h e re w as a l i n a g e re l a
12、 t i o n o f a b s o r b a n c e w i t h t h e k n o w n c o n - c e n tr a t i o n o f E v a n s b l u e f r o m 0 . 3 1 2 t o 1 0 0 m g / L( r = 0 . 卯9 . n = 7 .尸 0 . 0 5 , P 0 . 0 5 , 吸光度无差别( 图3 ) 。 2 . 3 S P最佳浓度和时间的选择E B注射后 5 m i n , 1 0 m i n , 1 5 m in 每部位约0 . 2 c m 2 给予0 . 0 3 f eg , 0 . 1 ft
13、 g , 3 . 0 (L g S P ( 图 4 ) o E B 注射后1 0 m in , 给予0 . 1 p g S P 可得到最大的E B 吸光 T h e 0 g a v e . 1 ; / s i t e o f s u b s t a n c e P f o r s k i n c h a ll e n g e a t 1 0 m i n am axi m umE v a n s b l u e a b s o r b a n c e( A=0 . 3 0 8 1 0 . 0 3 5 . * P0 . 0 1 v s 5 E B注射后1 0 m i n , 给予 光度 m i n
14、 o r 1 5 m i n . n = 8 ) . 0 . 1 t g S P 可得到最大的E B吸 44 纯图 讨论 皮内注射H 1 和S P 可建立皮肤炎性损伤模型, 分光光度 计对 E B 检测线性范围宽, 结果可靠, 可对炎性损伤程度进行 量化评估。给予 0 . 5 % E B时, 炎症反应局部渗出明显, 多个 实验样本重复测定的 误差在允许范围内, 故选用0 . 5 %的E B 作为皮肤炎性反应程度的监测浓度。 H 1 和S P 在人类过敏性疾病的发生发展中起重要作 用 2 , 3 1 , E B 分子注射人血循环后, 立即与白蛋白结合, 当 H l / S l 介导的毛细血管扩张
15、时, E B随血浆白蛋白的渗出而使 试 验 部 位 呈 蓝 色 4 . H I 吸 光 度 最 高3 解部 位 与 对照 组比 较 差异显著, 且此时N S 诱导和非炎症诱导的A值接近, 故选用 1 6 2 7 3 P g 作为皮肤炎性模型诱导的最佳浓度( 图3 ) 0 3 种浓度S P 不同时间比 较, E B 注射后 1 0 m i n , 效果最佳( P 0 . 0 1 ) , 故用 于研究皮肤炎症模型的建立( 图4 ) a 研究也显示H l / S P 及其受体的相互作用与反应性皮肤 模型的调控相关, 并与炎性反应的引发有关 5 1 。 该结果用量 化分析法直接证明急性炎性反应中, H
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