FR.MULV小鼠红白血病模型的建立及叠氮胸苷抗病毒作用的研究.pdf
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1、中国药理学通报C h i n e s e 尸胁胍伽如酊积B u l l e t i n 2 0 0 8N o v ;2 4 ( I I ) :1 4 8 9 9 11 4 8 9 F r M u L V 小鼠红白血病模型的建立 及叠氮胸苷抗病毒作用的研究 姜晶1 ,崔晓兰2 ,时宇静2 ,宋美艳1 ,高英杰2 ,王意忠1 ( 1 北京大学航天临床医学院,北京1 0 0 0 4 9 ;2 中国中医科学院中药所药理室,北京1 0 0 7 0 0 ) 中国图书分类号:R - 3 3 2 ;R3 2 9 2 4 ;R3 6 3 - 3 3 2 ;R3 7 3 9 ; R3 9 4 2 ;R7 3 3
2、7 3 0 2 2 ;R7 3 3 7 3 0 5 ;R 9 7 8 7 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1 1 9 7 8 ( 2 0 0 8 ) 1 1 1 4 8 9 一0 3 摘要:目的应用F r i e n d 鼠白血病病毒( F r i e n dr o u t i n el e u k e m i av i r u s ,F r M u L V ) 建立小鼠红白血病模型,并在此模型上 观察抗逆转录病毒药物叠氮胸苷( Z i d o v u d i n e ,A Z T ) 的治疗 作用。方法用F r M u L V 感染B A L B c 小鼠。以R T - P C R 法
3、测定脾脏病毒载量;血常规分析自细胞( W B C ) 、血红蛋白 ( H b g ) 及血小板( P L T ) 变化;镜检计数外周血及骨髓有核细 胞。结果与正常对照组相比,模型组小鼠脾脏病毒载量、 W B C 和H b g 明显升高;外周血及骨髓中红系和非红系均出 现大量原始和幼稚细胞,骨髓中非红系原始细胞( N E C ) 计数 0 3 0 ,有核红细胞0 5 0 ;A Z T 治疗组上述指标明显改 善。结论用F r M u L V 感染B A L B e 小鼠成功建立小鼠红 自血病模型,A Z T 在此模型上显示出良好的抗病毒作用。 关键词:F r i e n d 鼠白血病病毒;红白血病
4、;逆转录病毒;叠氮 胸苷 目前认为自血病的发生除与遗传和环境等因素 有关外,还与病毒感染密切相关。例如逆转录病毒 科中成人T 淋巴细胞白血病病毒( h u m a nT - c e l ll e u k e m i av i r u s ,H T L V ) 可引起人类T 淋巴细胞白血 病。为了进一步研究病毒感染与白血病的关系, 我实验室从美国经典培养物收藏中心( A T C C ) 引进 一株鼠逆转录病毒F r M u L V ,用其感染B A L B e 小鼠后,观察小鼠的发病情况,以探讨F r M u L V 的 致白血病作用,同时在此模型上观察抗逆转录病毒 药物A Z T 的治疗作用。
5、 l 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 主要试剂及仪器i n v i t r o g e nR N A 提取试剂 ( T R I z 0 1 ) ;宝生物P C R 试剂盒;针对F r M u L Ve n v 收稿日期:2 0 0 8 一0 7 2 I 。修回日期:2 0 0 8 0 9 一0 7 基金项目:国家“十一五”科技支撑资助项目( N o2 0 0 6 B A l 0 8 8 0 4 - 0 2 ) 作者简介:姜晶( 1 9 8 1 一) 。女,硕士生,研究方向:病毒感染与白血 病的关系。T e l :0 1 0 - 8 8 1 8 0 9 6 2 ,E m a i l :j
6、j m a i d o u 1 6 3 c o m ; 王意忠( 1 9 5 9 一) ,男,博士,主任医师,硕士生导师,研究 方向:白血病的发病机制,通讯作者,T e l :0 1 0 - 8 8 2 0 0 4 5 0 。E - m a i l :w a n g y i z h o n 9 2 8 1 2 s i n a 啪 m R N A 基因序列设计的引物分别是:5 一C A A C C A C 一一 C C T C T G T G G A C T r - 3 和5 一T G T A A A C C G G A T A G C C A A G G - 3 ,预期扩增产物片断长度为4 8
7、 7b p ;针对 看家基因B - a c t i nm R N A 基因序列的引物分别是:5 T G G A A T C C T G T G G C A T C C A T G A A C - 3 和57 一T A A A A C G C A G C T C A G T A A c A G T c c G - 3 ,预期扩增产物片断 长度为3 4 9b p ;引物由英骏生物技术有限公司合成。 A B IG e n eA m pP C Rs y s t e m9 7 0 0P C R 仪;c e l h a e M E K - 6 3 1 8 K 血细胞分析仪。 1 1 2 动物B A L B
8、 e 小鼠,S P F 级,早6 各半,体 重( 1 8 1 ) g 。由北京维通利华试验动物技术有限 公司提供。 1 1 3 病毒株F r M u L V 购自A T C C ,在B A L B c 小鼠体内传代,一7 0 保存。 1 1 4 药物克度( 齐多夫定片,A Z T ) ,东北制药 总厂产品,购自中国医药保健品进出口总公司。 1 2 方法 1 2 1 小鼠模型的建立及给药参照文献口J ,将 感染F r M u L V 的发病小鼠的脾脏无菌取出,研磨, 用D M E M 制成质量体积比为1 :1 0 的悬液,4 。C2 0 1 0 3r r a i n 一离心1 0m i n ,取
9、其上清腹腔感染小 鼠。感染后2h ,A Z T 以9 0m g k g d 一的剂量灌 胃给药,正常对照组、模型对照组以生理盐水灌胃, 每日1 次,连续2 8d 。 1 2 2 脾脏病毒载量的测定参照文献1 用T R I z o l 试剂提取脾细胞中病毒R N A ,参照试剂盒说明一 进行逆转录反应,制备c D N A ,反应总体积为2 0 山, 反应在4 2 孵育6 0m i n ,9 5 5m i n 终止反应。参 照试剂盒说明进行P C R 反应,反应体系总体积为2 5 m ,P C R 反应循环参数设置为:变性温度9 4 0 C ,3 0S ; 退火温度5 5 ,3 08 ;延伸温度7
10、 2 ,1m i n 。共3 0 个循环,7 2 保温5m i n 【4J 。P C R 产物的定量采用 琼脂糖凝胶电泳,A l p h aI n n o t e e hC o r p o r a t i o n 凝胶成 像仪记录图像并分析。 1 2 3 外周血血常规分析白细胞( W B C ) 、血红 蛋白( H b g ) 、血小板( P L T ) 计数。 1 2 4 白血病类型的诊断外周血及骨髓涂片,瑞 氏一姬姆萨染色,镜检计数有核细胞并观察细胞形 万方数据 1 4 9 0 中国药理学通报C h i n e s eP M r m a c o l o g i c u lB u l l e
11、 t i n 2 0 0 8N o v ;2 4 ( 1 1 ) 态。 1 3 统计学处理应用S P S S1 1 0 对实验数据进 行分析,数据结果采用x s 表示,组间比较采用t 检 验。 2 结果 2 I 对脾脏病毒载量的影响结果显示,模型组脾 脏病毒载量较高,条带较亮;A Z T 组病毒载量明显减 弱;而正常对照组未检出病毒R N A ( F i 9 1 ) 。定量分 析结果见T a b1 。 r i g1 R e s u l t so fv i r a ll o a di ns # e e na n e ri n f e c t e db y F r M u L V2 8d a y
12、s 1 :M a r k e r ;2 :C o n t r o l ;3 :M o d e l ;4 :Z i d o v u d i n e T a b1 Q u a n t i t a t i v er e s u l t ;o fv i r a ll o a di n 罐I 嘲a f a ri n f e c t e db y F r M u L V2 8d a y s ( 算3 ,n = 6 ) D 竺咝:k :! :生:!竺! C o n t r o l0 M o d e l I 3 1 O 1 4 N Z i d o v u d i n e9 0O 4 3 0 1 5 。 V i
13、 r a ll o a d = i n t e g r a t e dd e n s i t yv a l u eo fv i m s B a c t m ”P 0 5 0 ( 0 5 4 O 8 2 ) ,红系可见双 核、多核及芽状核细胞,以中、晚幼红细胞为主。符 合急性红白血病的诊断标准”6J 。见F i g2 。 F i g2M a r r o w 嘶g eo ft h em o d e l 1 0 0x ( W r i g h t - G i e t m a 醴a i l I i n g ) 3 讨论 急性红白血病是一种异质性血液系统恶性肿 瘤,可同时累及多个细胞系,临床预后较差。由于
14、该 亚型急性白血病相对少见,对其生物学表型了解不 多。小鼠红白血病模型是研究红系造血、红系恶性 疾病较为理想的动物模型【7J 。F r M u L V 是小鼠白 血病病毒一个亚型,属于逆转录病毒,可诱发小鼠急 性红白血病9J 。 模型小鼠感染后4w k ,外周血及骨髓涂片均支 持急性红白血病的诊断。但是临床上急性红白血病 的患者,多有外周血H b g 及P 降低,而实验中模 型小鼠H b g 明显升高,P L T 也有升高的趋势,且解剖 发现部分小鼠出现脾栓塞、梗死,因此考虑模型鼠可 能并发真性红细胞增多症,具体原因有待进一步研 究。A Z T 可有效抗逆转录病毒,在世界范围内已被 广泛使用治
15、疗艾滋病,它能有效清除A I D S 病患者 体内的病毒【l0 | ,实验中它对小鼠体内F r M u L V 也 有很好的清除作用,并且外周血和骨髓中没有发现 白血病细胞,显示出良好的治疗效果。但是在一部 分感染鼠中仍然可以测到低水平的病毒,这些低水 平的病毒负荷可能在感染阈值以下 1 1 | 。 用F r M u L V 感染B A L B c 小鼠诱发的小鼠红 白血病模型,具有安全、重复性好、实验周期短、价格 万方数据 中国药理学通报C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n 2 0 0 8N o v ;2 4 (
16、I I )1 4 9 1 便宜等优点,是一种研究人类红白血病较理想小动 物模型。 参考文献: 1 N a g a M ,K i l n mN ,A k i y o s h iT ,e la 1 T - s t e mc e l ll c o k e m i a l y - m o p h o m aw i t hb o t hl i n e a g ec o n v e r s i o na n dT - s p e c i f i cd e l t ar e c o n - b i n a f i o n J k l | J R e s ,1 9 9 7 ,2 1 :7 6 3 7 3 2
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