DNA改组技术及其在蛋白类药物定向进化中的应用.pdf
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1、D N A 改组技术及其在蛋白类药物定向进化中的应用 李奇璋黄蕾周选围唐克轩 自D N A 重组( D N As h u m i n g ) 技术诞生以来,作 为现代生物技术核心的基因工程技术得到了飞速的 发展,特别是改组技术在基因重组,分子、蛋白蛋进 化等领域得到了快速的发展,开创了定向分子进化 的新纪元。和常规进化相比,定向进化具有快速、高 效的特点。比随机诱变显著地提高了良性突变的概 率,且改组技术的方法巧妙,重点突出,着重实效,能 够在几年甚至几天内完成对特定基因的进化改造, 满足人们的需求。虽然随机突变、盒式突变以及同源 重组等都能够达到体外定向进化的目的,但是以 D N A 重组技
2、术为基础的D N A 改组技术能够获得更 加多样性的突变文库及更高的适应性 1 i 。 1D N A 改组技术 D N A 改组又称有性聚合酶链反应( s e x u a J P C R ) 是指D N A 分子的体外重组,是基因在分子水 平上进行的有性重组( 跎x u a lr e c o m b i n a t i o n ) 。通过 D N As h u m i n g 技术,既可对单基因或D N A 片段进行 改组,也可对基因组或染色体等进行改组 2 f 。 1 1单基因或D N A 片段的改组 1 1 1 交错延伸过程的改组:所谓交错延伸( s t a g g e r e x t e
3、 n s i o np r o c e s s ,s t E P ) ,是指在P C R 反应中把常规 的退火和延伸合并为一步,通过极简短的退火,与不 同的模板不断地延伸。直到形成全长子链。由于每次 退火都和不同的模板配对因此在合成的子链中包 含了不同的亲本的遗传信息。从而显示出新的遗传 特征。1 9 9 8 年,z h a o 等 , 利用该方法,对枯草杆菌蛋 白酶E 基因定向进化。通过一轮易错P C R 和筛选, 得到了5 株热稳定的突变株。再以这5 株突变株为 模板,建立S t E P 重组文库进行改组。得到的热稳定 性最强的突变体比野生型在6 5 时的半衰期提高 了5 0 倍。S t
4、E P 法是将D N AS h u f n i n g 技术简化,在每 基金项目:国家自然科学基金面上项目( 3 0 7 7 1 5 0 0 ) 作者单位:2 0 0 2 4 0 上海交通大学农业与生物学院植物生物技术 研究中心 通讯作者:周选围,E l I l a i l :x u w e i z l l o u s j t u e d u c n ;x I l 锄一 w e i 出 1 6 3 次的退火过程中,引物都与不同的模板结合,延伸。 它采用变换模板的方式,简便而有效,为酶的体外定 向进化又提供了一个强有力的方法。 1 1 2基因家族改组:基因家族改组( g e n e i l y
5、s h u f l l i n g ) 是指把具有相似功能的一组基因,通过改 组技术定向进化。1 9 9 8 年C r 哪e r i 等 】以序列同源 性为5 8 8 2 的四种头孢菌素酶C 基因为实验材 料。当分别以这四种基因为改组底物进行D N A 改 组。其抗性增强了8 倍;而以这四种基因共同作为底 物进行改组时,其抗性提高了2 7 0 倍( 和野生型的 e n t e r o b a c t e r ,c i t r o b a c t e r 基因相比) 到5 4 0 倍( 和野生 型k l e b s i e U a ,y e r s i n i a 基因相比) 。最佳的克隆包含了
6、 四种底物基因中三种基因的8 个片段,以及有3 3 个 氨基酸位点的突变。在自然界的进化过程中,物种之 间的遗传信息的交换是受到限制的。而基因家族改 组技术打破了这种限制。实现了单基因在不同物种 中的遗传信息交换。 通常,在D N A 改组的过程中,使用的是双链的 D N A ( d o u b l es t m n d e dD N A ,d sD N A ) 作为底物。 K i k u c h i 等 5 】以单链D N A ( s i n g l es t r a m d e dD N A ,s s D N A ) 代替d sD N A 作为底物进行改组实验。他们以 两种儿茶酚2 ,3
7、一双氧酶( c a t e c h o l2 ,3 一d i o x y g e n a u s e ) 基因,渤日和戈仰作为实验对象。当,础日和戈彬E 经过s sD N A 改组后。其嵌合率达到了1 4 。远远高 于d sD N A 改组的1 的嵌合率并且其基因产物 N a h H 和X y l E 有更高的热稳定性。同时,他们认为单 链改组可能被用于任何基因家族的改组。 1 2 基因组或染色体的改组 2 0 0 2 年,z h a n g 等 6 首次提出了整个基因组的 改组。利用该方法,提高了乳酸菌( 1 a c t o b a c i l l u s ) 的 耐酸性 7 | 。2 0
8、0 6 年,S u 西y a m a 等 8 】在对酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的 弘Z h 及膨f 47 h 型菌株 的研究中,实现了两种菌株相应染色体片段的交换 并将这种新的技术称之为“染色体改组”。 1 3 与其他技术相结合的改组 随着分子生物学和基因工程的发展。促进了改 万方数据 5 9 0 组技术的进一步发展。1 9 9 9 年,O s t e 珊e i e r 等 9 提出 了不依赖于同源序列的改组,即将D N A 改组技术与 I T C H Y ( i n c r e m e n t a lt m n
9、 c a t i o nf o rt h ec r e a t i o no fh y 一 妊de n z Y m e s ) 技术相结合。在之前的研究中,他们将 Ec o 尻p u r 基因的甘氨酰胺核苷酸( G A R ) 结合域 和甲酰四氢叶酸结合及催化域融合,得到了一个杂 合酶但是活性很低。因此,利用递增切断的方法使 基因重组。他们利用核酸外切酶( E x o ) 消化A 、 B 两种基因,以建立递增切断文库( I T L ) ,混合后用 D N 鹪eI 进行消化。改组,从而建立S C m T C H Y 文 库。2 0 0 2 年,O M a i l l e 等【1 0 利用S C
10、O P E 技术( s t l l l c t u r e b a s e dc o 瑚b i n a t o r i a lp r o t e i ne n g i n e e d n g ) ,将氨基 酸序列同源性仅为1 8 、核苷酸序列没有同源性的鼠 的D N A 聚合酶B 和非洲猪瘟病毒( A S F V ) D N A 聚合 酶x 成功改组。2 0 0 3 年,H i r a g a 和A m o l d n 坡展了一 种更加简便的重组方法。该方法能够使相关性更小, 甚至没有相关性的蛋白在多不连续的位点发生重 组,即S I S D C( s e q u e n c e i n d e
11、 p e n d e n ts i t e d i r e c t e d c h i m e r a g e n e s i s ) 技术。 2 基因突变体文库的筛选 基因突变体文库建立之后,如何建立一个简单、 快速、高效、灵敏的筛选方法,决定着改组技术的成 败和效率。目前,常见的筛选方法有以下几种。 2 1 琼脂板涂布法:琼脂板涂布法,就是在特殊的 平板培养基( 含有抗生素,或是营养缺陷,温度,酸碱 环境等) 上培养宿主细胞,通过宿主菌的生长情况、 培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的 基因。从而达到筛选的目的。琼脂板涂布法对于对平 板培养基有特殊反应的宿主细胞的筛选。具有高通 量
12、的特点。但是其适用范围比较窄。 2 2 噬菌体展示技术:1 9 8 5 年,S m i t l l 等 n 】首次提出 噬茵体展示( p h a g ed i s p l a y ) 技术,即一种利用蛋白 质互作作用的体外免疫系统。当外源D N A 片段分子 插入到丝状噬菌体基因组的外壳蛋白基因中时,外 源片段的D N A 分子所编码的产物可以与外壳蛋白 一起形成一个融合蛋白质,显示在噬菌体的表面。利 用此外源基因编码产物的抗体。通过抗原抗体的亲 和作用,就能从大量噬菌体中分离出含有所要基因 的融合噬菌体。噬菌体展示技术筛选方法简便,实现 了基因型与表现型之间的转换便于分离目的基因。 2 3
13、细胞表面展示技术:细胞表面展示技术,是将 外源蛋白基因与载体蛋白基因融合后导入宿主细 胞,使外源蛋白基因表达并定位于细胞表面的技术。 细胞表面展示系统由外源蛋白、载体蛋白和宿主细 胞三部分组成。一个好的宿主细胞,必须能和外源蛋 白兼容并且容易培养。细胞表面展示技术不仅可以 用于蛋白质类的表达,也可以用于多糖、糖蛋白等生 物大分子的表达。 2 4 核糖体展示技术和m R N A 展示技术:核糖体展 示技术和m R N A 展示技术都是在体外无细胞系中 进行的。核糖体展示技术,即体外翻译没有终止子的 m R N A 文库,并使外源蛋白质的基因型和表型以 m R N 卜核糖体一蛋白质复合物的形式耦联
14、在一 起,进行筛选。m R N A 体外展示技术又称为m R N J 卜 蛋白质融合体展示技术。与核糖体展示技术不同的 是m R N A 与其所翻译的蛋白质的结合是依靠一个 小分子嘌呤霉素的作用。从而实现了基因型与 表型的结合。核糖体展示技术与m R N A 展示技术由 于是在体外无细胞系体系中进行的,用m R N A 的可 重复性使目的基因( 蛋白) 得到有效富集。不受细胞 转化效率的限制,大大提高了文库容量和筛选通 量。 3D N A 改组技术在蛋白质药物上的应用 蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克 隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗等。通常,蛋白质 药物的分子量较大。与以往的小分子药物
15、相比。蛋白 质药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明 确、有利于临床应用等特点。 3 1 细胞因子 细胞因子( c y t o k i n e ) 又称为细胞素,是由免疫细 胞( 如单核细胞、巨噬细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细 胞、N K 细胞等) 和某些非免疫细胞( 如血管内皮细 胞、表皮细胞、成纤维细胞和角质细胞等) 合成和分 泌的具有介导、调节免疫和细胞生长、造血和炎症反 应等密切相关的高活性多功能的小分子蛋白质。细 胞因子在细胞之间传递信息,调节的生理过程,在免 疫调节、抗肿瘤、促进造血与组织修补、炎症反应及 神经内分泌等方面具有十分重要的作用。根据细胞 因子的功能分为:白细胞介
16、素( I L ) 、干扰素( I F N ) 、 集落刺激因子( C S F ) 、肿瘤坏死因子( T N F ) 、趋化性 细胞因子( c h e m o k i n e ) 和生长因子( G F ) 6 类。当机 体由于某些原因导致体内某种或某几种细胞因子的 相对或是绝对的缺乏而导致机体免疫学功能的紊 乱,通过对机体输入外源细胞因子以补充其不足,使 其恢复免疫学功能,从而达到治疗疾病的目的。因 此对细胞因子的研究就显得具有非常重要的理论 万方数据 和实用意义。 经病毒感染的细胞会产生一种细胞因子,可以 抵抗病毒的感染干扰病毒的复制。因而命名为干扰 素( i n t e r f e r o
17、n ,I F N ) 。I F N 除了有抗病毒作用外,还 有抗肿瘤、免疫调节、控制细胞增殖及引起发热等作 用。根据其来源和结构,可将I F N 分为I N F a ,B ,7 , 它们分别由白细胞、纤维细胞和活化T 细胞产生。其 中I F N 一仅因具有显著抗病毒功能而被广泛应用于 人类病毒性疾病的预防和治疗。1 9 9 9 年,C h a J l g 等【1 2 】 对2 0 多种人仅干扰素( h u m 蚰i n t e 彘r o n a l p h a ,H u - I F N a ) 基因进行改组。第一轮改组中得到的突变体 活性比H u I F N 一仅2 a 提高了1 3 50 0
18、 0 倍。第二轮改 组得到的活性最高的突变体比H u I F N d 2 a 的活 性提高了2 8 50 0 0 倍比H u I F N 吨l 的活性提高了 1 8 5 倍。基因工程干扰素a 是我国第一批被批准投 产的高科技生物新药。目前。它是治疗乙型、丙型肝 炎和恶性肿瘤的重要药物但临床疗效不怎么理想。 段朝军等c 1 3 】应用D N A 改组技术重组1 2 种人a 型 干扰素基因,得到的I F N d S 克隆,显示了很高的抗 病毒活性,比活达1 O 1 0 9U ,m g ,是目前国际上已投 产的0 【2 型干扰素的5 倍。吴明福等 1 4 利用D N A 改 组技术对人、鸡和猪俚干扰
19、素基因进行人工改造, 使三种基因混合后定向进化得到了一个质量高的 a 干扰素基因家族定向文库。初步分析,得到的基因 与上述三种动物的遗传距离靠近同源性非常高。为 筛选高质量的仪干扰素奠定了基础。 在免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞 因子称为白细胞介素( i n t e r l e u k i n ,I L ) ,它们是一类 非常重要的细胞因子家族。在免疫细胞的成熟、活 化、增殖和免疫调节等过程中发挥着重要的作用。 k o n g 等 1 5 从七个哺乳动物的I L - 1 2 的基因中,利用 改组得到的最好的突变型E v I L 1 2 其促人T 细胞 增殖的能力比天然的人白细胞介素1 2
20、 ( h I L 一1 2 ) 提 高了1 2 8 倍。x i e 等 1 6 在对I L - 2 的研究过程中,将西 藏猪、人、耗牛和小鼠的I L 一2c D N A 进行改组,得到 的I L - 2 S 突变型明显提高了猪淋巴细胞的增殖。 3 2 酶类药物 酶类药物( e n z y m ed n l g s ) 主要是指一类具有治 疗疾病作用的酶类蛋白质。2 0 世纪6 0 年代,d e D u v e 提出酶类药物是替代治疗遗传缺陷病的一种 可行方式。早期酶类药物的临床应用主要用于消化 及消炎。随着生物技术的发展,酶类药物在治疗遗传 性疾病、传染性疾病、损伤组织及癌症等方面都起着 十分
21、重要的作用。酶分子结构中具有特定的活性部 位,该部位有严格的空间结构,一旦结构破坏,生物 活性和稳定性也就随之消失。另外,酶的稳定性与温 度有很大的关系一旦温度发生了变化,酶就会因变 性而失活。因此。酶的稳定性及活性在应用方面就显 得尤为重要。目前对酶类药物的定向进化,主要体 现在提高活性和增强稳定性上。 3 2 1 提高活性:喜树碱( c 锄p t o t l l e c i n s ,C P T ) 是一 种重要的抗癌物质它能够作用于人D N A 拓扑异构 酶I ( h u m 锄D N At o p o i s o m e r a I ,t o pI ) ,使其抑制复 制叉的形成,使D
22、N A 双链断裂,最终导致细胞死亡。 使用D N A 改组技术对人D N A 拓扑异构酶的碳末端 进行定向进化。筛选到的突变体,对喜树碱的敏感性 比野生型的提高了2 2 2 8 倍 盯 。 周政等 堪】对来源于雷氏普罗威登斯菌( p M f 一 如,l c 玩r e t 甸妒一) 、大肠杆菌( e s c k 廊 玩c o l 和 K z u 声e mc 如r o p 池的青霉素酰化酶( p e n i c i I l i nA c y l a s e ) 基因( 序列同源性为6 2 5 一9 6 9 ) 改组。通过 一轮重排及筛选获得了合成活力提高4 0 的突变 酶,并且发现a 亚基的重排对
23、酶的合成活力的提高 更加有效。 血清对氧磷酶( 1 1 l mp a r x o n 鹪e s ,P O N s ) 在有 机磷酸酯类的解毒以及动脉硬化的预防上起着重要 的作用。A h a r o n i 等 伯 对P O N s 进行改组得到的突变 体其有机磷酸酯水解活性比野生型的活性提高了 4 0 倍。 抗凝血酶( a n t i t h r l D m b i n ,A T - ) 是一种相 对分子质量为5 80 0 0 的血浆糖蛋白是血浆中重要 的生理性抗凝血因子。在维持血液的凝血与抗凝血 平衡中起重要的作用。它是多功能丝氨酸蛋白酶抑 制剂,承担血浆中7 0 的生理性抗凝血酶活性。A
24、T 一 在血液凝固级联反应和维持血液流动性方面发挥 主要调节作用。然而。A T 一在治疗时用量很大,平 均每个患者50 0 0 60 0 0U 。于群等【制对A r _ 基因 进行D N A 改组。获得了5 株高活性的克隆。这对 A T - 在临床应用上有着重要的意义。 3 2 2 增强稳定性:S t o o p 等 2 - 对血纤维蛋白溶酶原 催化抑制剂l ( p l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o rt y p el , P A I 1 ) 进行改组筛选到的突变体的半衰期比野生 型的提高了2 4 5 倍,突变位点在5 0
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- DNA 改组 技术 及其 蛋白 类药物 定向 进化 中的 应用
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